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标题:【讨论帖】GST pull-down 和Co-IP的关系

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发表于 2013-6-8 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】GST pull-down 和Co-IP的关系


GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。

GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
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 小中大
GST pull down 和 Coimmunoprecipitation关系问题

啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 学过生物的地球人都知道. 这是研究蛋白质相互作用的两种方法.
简单通俗的打个比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上, 除非蜂马牛不相及, 同类男女之间该发生的一般都会发生. 这种关系是直接的, 西方的.
Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 则是, 众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处. 研究一群男女间的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起, 也可能不会互相吸引, 但是到了生物系统的大环境中, 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
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 小中大
有关Control和多方取证.

我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.
这也是我们生理学家所关心的, 若是没有生理意义, 那还空谈什么关系.
尤其在蛋白实验里, 假阴性, 假阳性泛滥. 以为是真的东西, 实际是假的; 以为是假的东西, 实际上却是真的.
如何披沙捡金, 去伪存真? 就得靠缜密的阴性, 阳性对照组来帮助我们辨别.
要把蛋白和已知不相干的蛋白放在一起, 和已知相干的放在一起, 以此来检验实验手段是否能够区分这两种情况. 这样才知道他是不是对你"用情专一, 矢志不渝".
要通过移除一个蛋白, 来看另一个蛋白的生理表现. 看他是不是"没有你不行", 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
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 小中大
有关变化

人是会变化的, 正如构成人的蛋白一样.
蛋白在细胞内从被产生, 到被销毁, 并非一成不变, 而是非常动态的.
磷酸化, 去磷酸化; 泛素化, 去泛素化; 脂肪酸化, 脱脂肪酸化; 氧化, 还原; 局部或酸, 或碱; 或冷, 或热; 与其他蛋白或小分子物质如ATP, GTP的结合, 分离; 都会使蛋白的功能发生很大变化.
两个蛋白的关系可能在这种情况下会这样, 在那种情况下那样. 这些都是可以理解的. 有时候这些变化是可逆的, 比如磷酸化, 那么在脱磷酸化以后, 关系还可以维持. 有时变化是不可逆的, 比如氧化, 泛素化, 这时候, 关系便不可维持. 生死变化, 对蛋白都是常态; 对于基于蛋白的活生生的东西, 唯一不变的就是变化. 花如此, 人如此, 感情亦如此, 我们明白这一点就能怀更多的宽容, 理解之心.
细胞金元ATP, GTP这些小分子也可能起到极大的作用, 蛋白结合了他们就会变化, 蛋白的功能也会随之变化. 比如Ras, 在结合了GTP以后就变得非常活泼, 可以引发细胞分化, 形态变化. 不过, Ras 若是持续的结合GTP不放手, 那么细胞就会癌化. 所以, 细胞内的金钱不可缺少, 善持之可以为善, 执迷不误必定作恶.
构成人的基本单元蛋白都遵守这一规律, 万物静观皆自得, 具十全佛性, 我们可以从自己身上学到非常多有益的东西.

PS:最近学做IP和pull down ，把这个古老的话题重新提起，没想到还引起热议。 转自友人博客cuturl('http://freekenny.blogbus.com/logs/12764916.html') ，感谢Think Storm博主的精彩文字及对对生活哲学般的领悟，让我对这两个实验有了深刻的认识。
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发表于 2013-6-8 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主想象力真好，也有见地。佩服佩服

不过，在下有一点建议：
pull down , Coimmunoprecipitation 意思差不多，都可以是一对一或一对n个蛋白的相互作用筛选。

有的人喜欢做 pull down 有的人喜欢Coimmunoprecipitation。
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发表于 2013-6-8 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人过去也发过一个IP的比喻，放在一起：

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/13870391')

目前个人认为生物医学研究的瓶颈就是是否能制备高质量的适合多种用途的抗体。

很多所谓的主流研究方法都要依赖抗体。例如Western blot,免疫荧光，流式分析，ELISA，IP，CoIP, ChIP。个人对抗体制备的原理和方法不是很清楚，但是实际过程中很多并不想说明书上说的那样，结果是否漂亮，只有用了才知道。

Western blot应该是抗体的最基本功能，他的最后原理是抗体结合到膜上的抗原，然后通过二抗来显示其位置。免疫共沉淀的抗体就不一样了，他要保证能够将你的目标蛋白及其复合物牢固的结合并通过蛋白A或G将其沉下来。

举个简单的例子说明二者的不同，不知道是否正确，一男（抗体）与一女（抗原）热情的接吻，在床上（膜）可能很容易办到，上述过程类似WB，抗体的功能只是识别固定物（转膜）上的抗原，风平浪静。相反，一男（抗体）与一女（抗原）热情的接吻，在激流中就不容易办到，上述过程类似免疫沉淀，是动态环境下的识别，而且必须特异性的牢固结合，这种接吻要求是热吻，紧密结合，并且最终用一个钩子（免疫沉淀中叫蛋白A或G)将男的勾下来后，要保证男的还热吻者那个女的（即抗原）。因此要求这个男的（抗体）要紧紧的抱住那个女的（抗原）。可想而知激流中（免疫沉淀）对男的质量要求更高，一定要保证不与女的分手。如果男的还三心二意，可能抱的是其他的女人，这在免疫沉淀中就会产生非特异性条带。因此，免疫沉淀一定要设置对照IG抗体来沉淀，如果随便一个男的（对照IG）也能将某个女的抱下来，那这个女的就是“博爱”，不是真正需要的最爱（特异条带）。

鉴于目前很多男的（抗体）质量不可靠或者不能满足，因此大量的文献喜欢采用标签蛋白（例如，HIS,HA,GFP，MYC等）作为“特异男”来勾引“女”的。

个人认为需要一个个试，看那个能够用于免疫沉淀，有的抗体是针对男的“嘴巴”来设计的，这种抗体当然能够容易将女的抱下来，相反有的是针对其他部位设计制备抗体的，功能也就不一样了。

Co-Ip成功的关键主要有两个：1）男的质量。2）男女接吻时的环境（例如是否有其他干扰因素，沉淀的时间，温度，比例，旋转强度等）

不对指正。
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 小中大

【爱到细胞深处】
穿过纷繁复杂的生物圈，你来到我面前，是否有一条无形的碳链，冥冥中把你我相连？

你目光如水，浸润着我每一个体细胞。你声音似甘，环绕了我每一个核苷酸。你的爱自由扩散，不需要任何能量与载体……我无法逃避，构成细胞膜的双磷脂被你任意穿透，构成细胞核的DNA被你轻易俘虏。
你是线粒体，为我提供能量。你是叶绿体，让我拥有养份。你是溶酶体，溶化掉我一切……你又是核糖体，把我像氨基酸一样俘获。你又是内质网，把我像蛋白质一样加工。但你更是高尔基体，包裹了我，又把我轻易地放弃。

为什么我还是那么地爱你？
因为我感到，我们像两分子葡萄糖，条件成熟就能合成麦芽糖。
因为我希望，我们像两个氨基酸，脱去一分子无谓的水，就能相互连接成紧密的肽链。
因为我清楚，我们就是配对的脱氧核糖酸链，必将形成美丽的双螺旋。
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 小中大
其实是一个比较老的话题了，各大生物论坛基本都可以见到转贴，来源也无处考证,其实是过去马里兰大学读PH.D的道中人实验过程所悟 .
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 小中大
写得真复杂，我的一个师兄告诉我：
GST pull-down是年纪太小太害羞，只好找人拉皮条
Co-IP是年纪大了无所谓，当街一站，谁喜欢就谁上。

我服了我师兄
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 小中大

看各个帖子都是精华荟萃，我也来转个好贴与大家分享：

「 DNA的爱情宣言 」

思念是基因般多彩的书卷，

寂寞犹如病毒一样蔓延。

我把爱写进核酸探针，

深埋在你的复制起点。　　

就算紫外线在我们身边出现，

世间的一切都发生着基因突变，

我们的心依然像肽键一样紧紧相连。

追忆我们生物反应的日子，

你的笑容就像荧光素一样点亮了我的今天与明天。

而现在的你却为什么不在我身边？

纵然我的心碎成了冈崎片段，

你的心发生了电子跃迁，

也不能改变我对你的爱恋。

我想你就像抗体想着抗原，

你的美丽是使我冲动的乙酰胆碱。

数个春秋尽是数个夜无眠。　

每个碱基都代表着我们永恒的誓言。

期待那么一天，　

我们能再相见，

交织缠绕成尘世间最美妙的双螺旋。

我站在大肠杆菌群中，

从头脑里倒出你的影子，

等待着PCR技术把你带到我的眼前。

退火，延伸......

又延伸.

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