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标题:【求助】丙酮沉淀的困惑！

uuooii[使用道具]
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发表于 2013-6-19 14:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】丙酮沉淀的困惑！


丙酮沉淀都说会丢失蛋白质，可是还有这么多人用沉淀法！
1、到底会丢失多少蛋白质？？
2、为什么会丢失？？？
3、尿素和其他裂解液的成分溶于丙酮吗？？如果跟着沉淀下来，会不会影响上样液中各种成分的浓度，进而影响聚焦？
4、丙酮风干不充分，会影响IEF聚焦吗？？
5、一般你们沉淀多久？？？最少多久？？？
6、丙酮沉淀真的可以去除离子吗？我的标本同样沉淀，为什么有时电压上不去有时上的去？
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发表于 2013-6-19 14:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1,肯定会丢失蛋白质,具体丢多少取决于样品的种类.
2,有些蛋白质一经沉淀之后难以再溶解.
3,应该不会跟着沉淀下来,至少绝大部分不会.
4,一般5分钟风干足够了,尽量充分.
5,最少2小时以上以沉淀完全,减少丢失的蛋白质。偶常用沉淀过夜。
６，可去除大部分离子，但还有一小部分会跟着沉淀。
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uuooii[使用道具]
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发表于 2013-6-19 14:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢斑竹对新的、大的、经常问菜鸟问题的菜鸟的帮助。
感谢。
您的丙酮中加DTT吗？有必要吗？？
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发表于 2013-6-19 14:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 uuooii 于 2013-6-19 14:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢斑竹对新的、大的、经常问菜鸟问题的菜鸟的帮助。
感谢。
您的丙酮中加DTT吗？有必要吗？？


您的问题有难度啊。偶的建议仅供参考，具体还需要您自己摸索。
丙酮中可以加ＤＴＴ，也可以不加。
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-6-19 14:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议还是加,对溶解性有好处.-20度沉淀过夜没问题.
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发表于 2013-6-19 14:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用丙酮沉淀发酵液的蛋白质，发酵液含有磷酸盐缓存液，用丙酮沉淀后盐含量很高。我做了一个对照试验，将丙酮直接加在一定浓度磷酸盐缓存液中，明显看到白色的沉淀，我感觉丙酮的去盐不好。
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发表于 2013-6-19 14:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我倒经常用TCA和丙酮；
Amersham的clean-up kit也是TCA和丙酮，但还有其它的。斑竹或那位知道它有哪些啊？？？？？（kit好贵啊)
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发表于 2013-6-19 14:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qumm1985 于 2013-6-19 14:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我倒经常用TCA和丙酮；
Amersham的clean-up kit也是TCA和丙酮，但还有其它的。斑竹或那位知道它有哪些啊？？？？？（kit好贵啊)

您是指KIT的配方吗,不好意思,偶知道的和您一样多,呵呵.
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uuooii[使用道具]
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发表于 2013-6-19 14:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用丙酮沉淀发酵液的蛋白质，发酵液含有磷酸盐缓存液，用丙酮沉淀后盐含量很高。我做了一个对照试验，将丙酮直接加在一定浓度磷酸盐缓存液中，明显看到白色的沉淀，我感觉丙酮的去盐不好。

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谢谢你，我也是因为有些怀疑这个才发帖子的。你都用盐溶液试过了，事实胜于雄辩，看来去盐最多只是一部分。
根据你的提示，回头我试试向裂解液中加丙酮，看看尿素等会不会沉淀下来。
另外，丙酮不是夺取水分，蛋白才会沉淀下来吗？？所以溶于水的成分必然会沉淀下来。这是我的理论上的推测。（供大家讨论丙酮沉淀的原理）
另外我还觉得，如果裂解液的成分跟着沉淀下来，会影响上样液中各种成分的浓度，进而影响聚焦。
所以我觉得沉淀应该考虑裂解液的成分和浓度。（个人观点，供大家讨论）
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uuooii[使用道具]
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发表于 2013-6-19 14:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家继续讨论，TCA/丙酮沉淀和单独丙酮沉淀的比较。
原理，各自特点，以及沉淀过程中注意的问题。
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