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标题:【求助】双向电泳电压上不去

shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-19 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】双向电泳电压上不去


肝脏研磨，细胞裂解液提取（7M尿素，2M硫脲，4%的CHAPS，40mM的Tris），20000转离心取上清，使用丙酮过夜沉淀后，在使用细胞裂解液溶解，跑双向，发现等电聚焦电压上不去，到约800V，怀疑是Tris的问题，用3K的超滤膜超滤后用不含Tris的裂解液复溶后在跑双向发现电压还是上不去，更低了才300v。
为什么啊？愁死了，谢谢帮助。该怎么除掉盐，还是有核酸，脂肪啥的啊。
补充：阴极端有白色物质
经过各位的帮助，我已经跑出一张图了，不过还有很多问题，就是碱性端聚集，胶条是3-10的。请各位继续帮帮我谢谢


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2013-6-19 17:24
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发表于 2013-6-19 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有图吗？？什么样子？？
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-6-19 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有啊，电压上不去，一向没有跑完我就给它停了啊
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发表于 2013-6-19 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白浓度测定了没？？你上样前那裂解液的组成是什么啊？？
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-19 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
裂解液成分7M尿素，2M硫脲，4%的CHAPS，没有测定浓度，因为用BCA试剂盒测的时候，干扰太大，没有测出来。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-6-19 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不定量，你怎么确定你的上样量，这些都是有范围的，不是你意向想上多少就可以上多少的？建议你重新测蛋白浓度，如果觉得BCA法不好的话，就braford法测，这个相对来说对试剂的干扰性小点，当然，如果有条件的话，买定量试剂盒测更好，先把这步做好，再找你的问题。
先说下，电压上不去的原因有很多，初次判断就是样本盐离子高，缓冲液里的盐离子高等，所以很多时候会建议先除盐，不过你的是动物的肝脏组织，其实不用除盐也是可以的，我们实验室做过肝脏肺脏，胰腺，都没有经过除盐，跑出来的结果也还不错，你可以看文献上也很多是用一步提取法，直接上样跑的，所以你出现的这个问题，是可以通过合理的操作改进或优化的。
祝你好运！
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发表于 2013-6-19 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
裂解液成分7M尿素，2M硫脲，4%的CHAPS，没有测定浓度，因为用BCA试剂盒测的时候，干扰太大，没有测出来。

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你不加DTT,和载体两性电解质，可以直接跑等电聚焦吗？
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发表于 2013-6-19 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

除盐没除好
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-19 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你不加DTT,和载体两性电解质，可以直接跑等电聚焦吗？

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上样前加了DTT和IPGbuffer
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-19 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这次重新丙酮沉淀后，用新配的裂解液溶解，超滤后上样，本以为还行呢，现在预设电压跑8000v,10h，现在跑了1个半小时了，才到1500v，电流50uA（到了限定的值了），好没有信心呢。（前面低电压的到还是可以的）
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