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标题:【求助】超声破碎中遇到的困难和如何提取胞质蛋白

dream2013[使用道具]
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发表于 2013-6-20 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】超声破碎中遇到的困难和如何提取胞质蛋白


各位同仁：
我在试验中遇到一些困难，想在这里请教一下大家。
我想做一种蛋白的多抗，选择的是pET28a载体，因为考虑到它主要是包涵体表达所以我查找了一个方法试图提取包涵体。方法如下：
1 离心获得菌体，用同体积的细菌裂解液重悬（25mM Tris.cl:1mM EDTA:20%蔗糖：200mM Nacl )

2 液氮和37度之间反复冻融3此。

3 大功率超声15此，开始和暂停个30秒。

4 收集菌体，0.1mM Tris cl重悬，加入1%Tritongx-100超声3此，该步骤重复两次。

5 再用2M的脲洗涤两次，得到的为包涵体

但是我遇到的问题是，最后得到的沉淀重悬后是黑色的，跑电泳的结果就像是全菌液一样，根本没有纯度可言。不知这是为什么，还有没有什么更好的方法。

再有就是，我又做了一个小量表达的定位，是按照分子克隆做的，发现在胞浆和包涵体中都有表达，且条代的亮度都很高，于是我想从胞浆中提取蛋白来制多抗。请问各位，有什么集体的方法，获得胞浆蛋白，如果该方法不影响进一步的得到包涵体更好了。

首先谢谢您能耐心的阅读我遇到的困难，然后还要感谢丁香园给我提供了这样一个请教和询问的空间。
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发表于 2013-6-20 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最后得到的沉淀重悬后是黑色的，跑电泳的结果就像是全菌液一样

===========================================================================================================

1.可能是超声破碎间隔的时间不够长，导致菌体的炭化，从而使得最后得到的沉淀重悬后是黑色的。超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。建议你适当延长破碎间隔的时间，暂停1min试试。

2.你“大功率超声15次”，以及后来“加入1%Tritongx-100超声3次，该步骤重复两次”，根据我提包涵体的经验，我觉得次数太多了，最多10次就够了。次数过多会破坏你的包涵体蛋白。我用的是大肠杆菌KG表达载体表达的包涵体，超声破碎10次都看起来不清亮，不过后来跑PAGE胶还是有大量表达蛋白。

3.看超声裂解细菌是否完全，最简单的方法，就是：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察。切记：只用结晶紫染色。

你可参考：《包涵体的纯化和复性总结》
cuturl('http://www.bioon.com/experiment/mb/mb1/200410/80878.html')
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发表于 2013-6-20 09:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重悬后为黑色，主要应该是楼上所说的菌体的炭化，在超声波破碎时我都是在冰浴中进行的，可以使破碎时产生的热量尽快扩散。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-6-20 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重悬后为黑色，主要应该是楼上所说的菌体的炭化，在超声波破碎时我都是在冰浴中进行的，可以使破碎时产生的热量尽快扩散。
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dream2013[使用道具]
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发表于 2013-6-20 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢两位的指导,我在表达定位中发现在胞浆中也有可溶性表达,我可不可以30度诱导过夜,然后离心获得菌体,用含有溶菌酶的液体重悬,冻融几次后再超声.谢谢!
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发表于 2013-6-20 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
偶也来谈谈看法
1 最后的沉淀为黑色, 有可能超声炭化, 但也可能其它的原因,比如杂质, 化学试剂的影响等等
2 你的超声次数可能是多了点, 其实判断超声, 只要看一下菌液有没有从浑浊变澄清,如果已澄清,那大致就差不多了.
3 至于"跑电泳的结果就像是全菌液一样", 这是因为超声洗涤只能去除可溶性的蛋白(包括胞浆蛋白和一些膜蛋白), 一些不溶性的成分还在,所以看上去就变化不大了.
4 如果上清液中也有表达,那就好办了, 因为pET28a载体是带有His标签的,只要阅读框正确, His Tag得到表达的话, 你可以用Ni 柱进亲和纯化了(安玛西亚等好多公司有买, 方法试剂盒上有).
供参考!
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发表于 2013-6-20 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得超声前的冻融意义不大，还可能导致一些本来水溶性的蛋白聚集或变性，所以后面wash完，会有更多的杂蛋白留在pellet里。可以考虑加点溶菌酶，作用一段时间在去超声。
发酵完离心获得菌体pellet和sup，sup中很有可能是有活性的蛋白，可以直接纯化。这样可以避开包涵体复性的复杂过程。超声破碎的时候，一定要注意控温！
同时，pellet进行超声破碎，及纯化前的wash 和变性提取。wash的目的主要是在纯化前降低杂蛋白的量，一定程度上减少纯化的负担。
超声的buffer中不一定要有还原剂，要根据你的蛋白来定，不过wash buffer和extract buffer一般是要加还原剂的。wash buffer中的urea浓度可以为1~4M，Triton X-100一般在0.5~5%，要根据你的蛋白来具体情况具体对待，一般的包涵体是不会提取出来的，可以做个预实验，跑个SDS-PAGE就可以看出来的。这样可以得到比较纯的蛋白，然后再进行纯化和复性。

wash的条件摸好后，可以多处理一些，将待提取的pellet放在-80保存，可以保存很久，然后以此为起点，进行下面的纯化。
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dream2013[使用道具]
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 小中大

首先谢谢各位的赐教,我和大家说一下我得实验以及结果:

我的实验的问题主要是,我使用的载体是pET28a,手册上面说百分之九十以上都是包涵体表达,所以我开始的实验都是纯化包涵体,但做了一次定位发现,胞浆中也有相当量的表达.所以改变方法取提取胞浆.原来的超声获得包涵体时总是结果不好,有许多黑渣滓,而且洗的很不纯.所以对这中方法产生了不信任.
这次实验我摇了两瓶菌,分别用超声和tritonx-100破膜:先都在液氮和恒温箱中反复冻蓉3次,再分别用超声(300w 10s/1min30s 5次)和tritonx-100(终浓度为5%)来破膜,电泳结果很好,正在过柱纯化呢.

我得实验就是这样,很感谢各位给我的帮助,希望大家在我后面的实验中能不吝赐教.谢谢!
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 小中大
需要包浆中的蛋白可以在细胞破碎后离心收集上清，然后柱层析即可。收集包含体也可在破菌后离心收沉淀。
关于黑色东东 应该就是各位说的碳化结果，据我所知，超声破菌时一定要控制好温度。
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 小中大
你说＂判断超声, 只要看一下菌液有没有从浑浊变澄清,如果已澄清,那大致就差不多了＂，差不多的含义是什么？是不是说菌体已经差不多都破完了，可以不破了
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