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标题:【求助】再谈毕赤酵母的表达问题

8s5g[使用道具]
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发表于 2013-6-20 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】再谈毕赤酵母的表达问题


本人将目的基因重组到质粒pPIC9K中，转化酵母，G418筛选后，用甲醇诱导表达，未出现目的蛋白带，用AOX引物PCR鉴定有目的基因。何也？请各路大侠会诊相救。谢谢！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-6-20 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是如何鉴定没有目的蛋白带的？
G418主要用于筛选高拷贝的转化子，如果只初步筛选阳性转化子，用MM、MD平板就可以了。当然，最后还是要看表达出来没有。
你是用什么酶线性化表达载体质粒的？
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发表于 2013-6-20 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是用Sal1线性化质粒，PAGE和Western blot鉴定没有目的蛋白带的。表达使用过的培养基有BMMY, BMM, MM, 严格按照invitrogen公司的操作手册进行，一直没有目的蛋白的出现，同时使用的阳性对照Albumin有表达，就是我的蛋白没有表达。
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fox_79[使用道具]
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发表于 2013-6-20 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你再考虑以下问题：
1）你构建的载体测序确定过吗？正确吗？
2）9K是分泌表达，是否在分泌阶段出问题了？你可以用酵母细胞破碎液上清跑胶，与诱导前或者GS115的阴性样本做对照，看是否在胞内有新生带？
3）表达的目的蛋白分子量有多大？如果分子量太大，就不适合分泌表达。
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发表于 2013-6-20 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

构建的载体经测序是正确的；表达的目的蛋白有20KD，应该是可以分泌表达的；目前可以再做的是要破碎酵母细胞，看胞质内是否有新生带了，我再试试。谢谢楼上的指点！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2013-6-20 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多挑几个克隆试试
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发表于 2013-6-20 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近刚表达出一个6KD的多肽，我筛了100个左右，只找到一个表达量较高的，你是不是筛的少了，我是将5个克隆放一个瓶子里摇，一次50个克隆，一个周期10天左右
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发表于 2013-6-20 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么我表达一个5KD的多肽在上清没有检测到呢？如果上清需要浓缩看是否有蛋白怎么浓缩那？不过我只挑了一个克隆
楼上说筛了100个克隆每个都做表达工作量不是相当之大？要做多久啊？
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发表于 2013-6-20 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有个问题，拷贝数与表达量成正比吗？转化后的转化子是需要经过大量筛选后确定一表达量高的。如果筛选中需要换培养基，可以直接用50 毫升离心管进行筛选，这样中途离心也 方便。如是胞外表达，取上清跑蛋白胶，效率还可以，检测不到可以用 银染试试。
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uaubc[使用道具]
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发表于 2013-6-20 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议采用分辨率高的分析手段，因为酵母得表达量本来就很低，也有可能再sds-page上面显示不出来，所以你可以用western blotting或者用银染，看是不是存在表达量低得问题。
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