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标题:【求助】western目的条带弱且背景深,且条带大小不对...

daod[使用道具]
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发表于 2013-6-26 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western目的条带弱且背景深,且条带大小不对...


第一个问题：
我做的蛋白，只有santa有我需要的抗体，发现抗体说明书中没有western图，说明santa也没有经过试验验证，只是按照02年的一篇文章上的结果注明蛋白分子量为60KD， 可我做出来的条带只有不到50KD（条带很弱，背景很深），现在很是郁闷我做出来的弱条带是否是杂带？
第二问题：
目的条带很弱，背景很深
我一抗稀释度1:200（没办法，谁让santa的效价低啊），二抗驴抗羊1:2000（是个其他公司的），我们实验室其他人用过效价很高，起初我用的5%的脱脂奶粉(光明，国产中的名牌）37度封闭1小时，发现背景很深，后来在园子里看到有人说羊抗一抗不能用牛奶或BSA封闭，因为羊与牛种属相近，会产生交叉反应，建议用二抗来源物种的血清封闭，我们实验室没有驴血清，但是有马血清，我想马和驴都能杂交，说明马和驴的亲缘关系应该很近，用马血清应该也没问题吧，后来在网络上查到western 封闭可以采用10%的马血清，我仿佛看到了曙光，但经过试验后（10%马血清，37度封闭1小时）发现，背景依然那么黑，所谓的目的条带继续很弱，弱的甚至都超出了肉眼的灵敏度范围。

这些日子天天在找原因，可找来找去发现每个原因都有可能（什么封闭时间不够，二抗浓度太高，建议4度过夜啥的），做了整整一个月了，崩溃了。换抗体还没发换，其他公司没有，让公司制备抗体那N个月过去了，质量还不敢保证，快毕业了，急啊！

不知大家谁用过santa 羊抗一抗，交流一下经验，哈！
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-6-26 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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我也用santa的抗体 出来的条带位置不对
不过它好像本来就是多克隆
背景黑 还是因为二抗没有洗干净
如果背景洗干净 可能目的条带能出来
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羊咩咩[使用道具]
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发表于 2013-6-26 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用的什么抗体，说来听听，我或许会有你的抗体
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daod[使用道具]
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发表于 2013-6-26 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的抗体是 PCGF6基因的，santa cruz 货号：SC-160649，说明书上啥图都没有，晕得！
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-6-26 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这学期以来也是纠结于santa的羊来源的一抗，我的一抗是santa羊抗鼠，二抗是博士德兔抗羊（后来换成中杉金桥进口分装的兔抗羊），5%脱脂奶粉封闭的也是背景很深，目的蛋白丰度又不高，很难得到理想的结果，后来试试用2.5%兔血清封闭结果背景依然很高，两个公司的二抗都是如此，有时候背景很高的膜接着把内参做了以后背景会减弱很多目的蛋白会清晰一些，不知有谁解决了这个问题的，赶紧分享下啊。
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-6-26 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我比较郁闷的是为什么二抗宿主的血清封闭液会有这么强背景啊
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发表于 2013-6-26 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到和大家一样的问题，开始背景不深时的条带是偏低点的位置，总怀疑位置不对。后来索性曝光时间长点，显影时间长点，发现更接近目的蛋白的位置有条带了，但是很细很弱，这时候背景已经很黑了，试过脱脂奶粉封闭，不改善。用的就是santa的羊抗小鼠二抗，不知道是二抗的问题还是一抗的问题。
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PINK[使用道具]
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发表于 2013-6-26 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Product / Company                Target        Quantity        Reactivity        Applications        Price       


PCGF6 monoclonal antibody (M01), clone 2B8

Abnova Corporation                PCGF6        100 ug        Human        ELISA       
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PCGF6 purified MaxPab mouse polyclonal antibody (B01P)

Abnova Corporation                PCGF6        50 ug        Human        Det Ab,WB-Tr       
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PCGF6 (polycomb group ring finger 6) Antibody (against the middle region of PCGF6) (50???g)

Aviva Systems Biology                PCGF6        50ug        Human        WB       
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PCGF6 antibody

Fitzgerald Industries International                PCGF6        50 ug        Human        WB, Other applications to be determined by end user       
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Rabbit Anti-Human PCGF6 Polyclonal Antibody, Unconjugated

GeneTex                PCGF6        100 ?l        Human        Western blot       
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Rabbit Anti-Human PCGF6, Internal Polyclonal Antibody,

LifeSpan BioSciences                PCGF6, Internal        50 ?g        Human        WB (1 ?g/ml)       
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Mouse Anti-Human PCGF6 Monoclonal, Unconjugated, Clone 2b8

Novus Biologicals                PCGF6        0.1mg        Human.        ELISA       
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Mouse Anti-Human PCGF6 Polyclonal, Unconjugated

Novus Biologicals                PCGF6        0.05mg        Human.        ELISA, Western Blot       
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PCGF6 (E-15)

Santa Cruz Biotechnology, Inc.                PCGF6        200 ?g/ml        Mouse, Rat, Human        WB, IF, ELISA       
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Mouse Anti-PCGF6 Antibody, Unconjugated

Sigma-Aldrich                PCGF6        Inquire        Rat, Human, Mouse        immunoblotting: suitable       
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Mouse Anti-PCGF6 Monoclonal Antibody, Unconjugated

Sigma-Aldrich                PCGF6        Inquire        Human        indirect ELISA: suitable       
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Rabbit Anti-PCGF6 Polyclonal Antibody, Unconjugated

Sigma-Aldrich                PCGF6        Inquire        Human, Mouse, Rat        immunoblotting: suitable
来源：cuturl('http://www.biocompare.com/ProductListings/3194/PCGF6.html?types=6-58107&sb=true')
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 小中大
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我也用santa的抗体 出来的条带位置不对
不过它好像本来就是多克隆
背景黑 还是因为二抗没有洗干净
如果背景洗干净 可能目的条带能出来

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我跟楼上一样，santa的抗体做western都能做出来，十几个指标都出来了，但是老师最近新买的一批抗体做是做出来了，好几个位置都不对，差几十个KD，很头痛，不知道群友后面怎样解决的。羊抗的有一个指标用过，是所有指标当中做出来条带最差的，粗而弥散的一条，黑倒是很黑，也能看出来是这一条，基本没有杂带，就是太难看了，条带中还有斑点，开始以为是什么脏东西，连续做了六七次，一直有。
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