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标题:【求助】纯化MBP融合蛋白

ha111[使用道具]
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1
 

【求助】纯化MBP融合蛋白

最近在用Amylose resin纯化MBP融合蛋白,但每次杂带都挺多的,各位大侠出出招吧!!!
SDS-PAGE电泳上样顺序为:超声上清、超声沉淀、流液、纯化1-5,纯化结果中最上面的条带为目的蛋白(本次试验诱导不是很好),之后更换诱导条件后,效果也是如此,为什么会出现这么多杂带,是蛋白降解了吗,还是非特异结合,或是其他原因,望大家指点一下,纯化怎么才能获得高纯度的蛋白!!!


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2013-6-26 18:00
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biabiade[使用道具]
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1. 从你的图中看来,你的resin根本就没有起作用,纯粹就是个筛子,什么蛋白都下来了。因此,你的蛋白很有可能没有挂到柱子上。
2、第二种可能性,你的洗脱液不合适,将靶蛋白和杂蛋白一起洗下来了。
3、还有一种可能性,就是虽然表达的蛋白是可溶性的,但是却像包涵体一样聚集在一起,无法为resin所捕捉。这就很不幸了,请看: About 20% of the MBP fusion proteins we have constructed do not bind efficiently to amylose resin. The reason for this is unclear, but it may be symptomatic of a fusion protein that exists in a soluble but aggregated state wherein the majority of the passenger protein is not properly folded. Sometimes better results can be obtained by performing amylose affinity chromatography at room temperature instead of 4 °C. This problem can also be circumvented by using vectors that are designed to produce MBP fusion proteins with additional accessory tags(具体参考附件内容。)
4、你没有说清楚各个泳道是什么,蛋白也没有标示位置和大小,无法判断是否降解。
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ha111[使用道具]
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下面第一个图是我诱导后全蛋白跑胶的图,条件应该没问题;第二是我纯化后的图,初做蛋白,好多不太清楚,大侠帮忙分析一下具体是什么原因造成的,非常感谢!!!


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ha111[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 ha111 于 2013-6-26 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
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下面第一个图是我诱导后全蛋白跑胶的图,条件应该没问题;第二是我纯化后的图,初做蛋白,好多不太清楚,大侠帮忙分析一下具体是什么原因造成的,非常感谢!!! ...

具体原因,主要就是我上面解释的三种。
对于1,你可以将蛋白loading到柱子上,不洗脱,或者直接用平衡液洗脱,看看蛋白是否流穿了;或者在洗脱之后,分别将resin和洗脱液定量后电泳,看蛋白到底在哪里。
对于2,你只能查阅文献,寻找合适的洗脱液了,但是这种标签蛋白一般洗脱液都是固定的。
对于3,你的蛋白这么大,有可能凝集在一起,没有呈现可溶状态。你可以试试用尿素将蛋白变性,然后再看看是否被resin所截获。
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ha111[使用道具]
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对于你提出的建议1,很值得尝试一次;你说我纯化的蛋白有可能凝集在一起,没呈现可溶状态,我觉得不可能,因为超声沉淀检测没有出现目的蛋白条带,说明还是可溶性的,我觉得可能是表达的蛋白没有正确的折叠,导致与resin结合不上,版主你说有可能吗?
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ha111[使用道具]
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6
 

版主,我还有个问题,就是怎么判断纯化后出现的杂带是目的蛋白降解的,还是其他的杂蛋白?


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你可以与空载体诱导表达的蛋白比较。
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MBP是靠氢键挂在柱子上的,所以盐浓度高的溶液会影响春花,含胍或尿素的蛋白100%挂不住。

看你的洗脱液里两个很强的条带一条有40kDa左右(MBP是42.5kDa),两条加起来感觉和靶蛋白大小接近,可能是降解了。
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ha111[使用道具]
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请问NBA版主怎么才可以防止操作过程中的降解,我是按照MBP protocol 做的,好几次结果都是这样,郁闷!!!
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一般防止降解可以尝试用高浓度的EDTA, 甘油或者去垢剂(个人偏好CHAPS),当然要看你柱子的承受能力而定。

你用的质粒是不是pMAL?如果MBP前面有His Tag完全可以用镍柱纯化

MBP和目的基因之间的多肽片断有多长?linker太长的话很容易会导致融合蛋白降解。
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ha111[使用道具]
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我用的质粒是pMAL,linker长度应该也没问题,主要是之前我的师姐做的很好,现在我却做不出来,郁闷!谢谢你NBA,我再找找原因吧!
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