液相色谱

　　随着药典中高效液相色谱应用的增加，在有机合成跟踪检测上的作用也与日俱增，它的快速，灵敏，准确，可同时分析多组分等优点正符合跟踪需要。有机合成跟踪分析从严格性上来说，明显低于药典的相关要求（当然，成品分析是要求与药典和相关标准是一样的），检测的主要目的是反映实验的进程和副反应变化，为实验条件选择，优化提供依据。以下是本人对反相色谱法跟踪分析过程的一点总结。

一、        准备阶段

　　这一阶段的工作类似于方法开发过程。首先，要了解反应的底物（原料）和产物的结构，理化性质等，为流动相，PH，色谱柱的选择提供依据，（方法开发站内已有大量的帖子，这里不再重复说明），反应使用溶剂的性质，这个也很重要，因为溶剂经常PH是超出色谱柱的使用范围的（如胺类溶剂，酸性反应液等），且在检测条件下可能有吸收，会干扰或误导分析，要做空白溶剂对照，在不引起反应液改变的前提下，调节供试品溶液的PH。在能用反相色谱的情况下，尽量使用反相，操作简便，分析条件较容易摸索得到；第二，选择初始流动相，通常为80%甲醇-水，这一条件下，可以确定反应液所有组分的出峰时间，再以10%，5 %或微调的比例调节有机相，从大到小，使之达到较佳的分离度（这一步如果有梯度泵，将带来极大的便利，几乎可以说是方法开发必备的利器）。检测波长低于 220nm的，一般选择乙腈为有机相比较适合，但也要根据样品的溶解性加以综合考虑。根据峰形，分离度等，看是否需要加入调节剂，如缓冲盐（增加缓冲盐浓度常有延长保留时间的趋势，但不是很明显，当分离度在1.0-1.5之间时，或可加以运用），三乙胺，离子对试剂，四氢呋喃（作调节剂时比例常不超过 10%），是否需要调节流动相的PH等，缓冲盐溶液通常为30mmonl/L的磷酸二氢钾溶液，扫尾剂常为0.5%或1%的三乙胺，或可增加两者的浓度。第三，波长的选择，由于反应液组分的复杂性与纯品的单一性不同，一般少用紫外分光光度计进行波长扫描，因为你扫描出的是多组分叠加后的吸收曲线，所以有 DAD检测器是最适合的，其次是停泵扫描,手上使用的是岛津SPD-20A的检测器，所以最常用的就是停泵扫描，此检测器有双波长检测功能，因此在第一次检测时，波长一般选择210nm（甲醇的截止波长）和254nm进行检测，此双波长下基本可以反映反应液的所有组分，确定各组分的出峰时间后，对各组分进行停泵扫描。最少扫描3次（曾遇上过假的扫描图谱），同时把扫描的吸收强度与相同时样量进色谱峰峰高对照，两者应基本一致，说明扫描正确。第四，柱温，我一般选择30℃，有需要再加以调整。
总而言之，这一阶段的最低要求是，要尽量使所有组分均被检出，各组分比例接近于实际含量，且达到一定的分离度和柱效；其次，是峰对称性在0.8-1.5之间即可；再次，就是要在尽量短的时间内完成检测以适应跟踪需求。尽可能先了解整个合成路线，使开发的方法能适用于整个合成过程，避免采用多个分析方法，以致每次都要对相应色谱峰进行定位和不断更换流动相，平衡色谱柱造成的时间浪费。

二、        跟踪阶段

　　此阶段检测重点是观察并如实记录反应液的变化情况，如各组分峰面积的变化，组分数目的变化，保留时间的变化及其与反应条件的关系。
1、        峰面积的变化正常情况下，应该原料峰面积减少，而产物峰面积增加。首先，原料峰的变化最容易判断，通过原料的保留时间定性和峰面积变化，就可判断原料是否有反应。其次，产物的峰面积应增加，但峰面积增加的未必就是所要的产物，也可能是副产物或中间态。
可以通过以下判断：
（1）最直观的表现，原料反应完全后，新出现的最大的峰往往就是产物峰；
（2）反应机理通过机理可能判断副反应进行的难易程度对峰面积的大小进行对照，如副反应很难进行，而有一色谱峰随着原料的减少而明显增加，那可能就是产物；
（3）物质的极性根据反应前后极性的变化，与原料进行比较，判断产物峰的可能位置，同时判断副产物的极性加以对照，并结合硅胶TLC的点位判断；
（4）根据原料上引入基团是助色团还是减色团，与在双波长下峰面积不同的比较。
（5）在原料基本反应完全后，提取，结晶出产物，以熔点，官能团鉴别来再一次确认；
（6）如果有下一步反应，取产物进行下一步反应，看反应现象是否符合理论，符合，则确定反应产物正确。
（7）以上方法都无法判断，可选择红外，质谱，核磁等进一步鉴别。产物确认后，以结晶后的产物返回对色谱峰进行定位。

[ 本帖最后由 yfdihdx 于 2010-1-4 11:46 编辑 ]

下面举一个经过酯化、胺化和水解三步反应的跟踪检测：
液相色谱仪：岛津LC-10A或LC-20A液相色谱仪，LCsolution或浙大N2000工作站。
色谱条件：岛津C18（250mm*4.6mm,5um），以30mmol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调PH＝3.0）-甲醇（70：30），检测波长：215nm，流速1.0ml/min
反应液组成：原料（含有酚羟基和侧链醇羟基，为可酯化部位），酯化基团（甲磺酰基），溶剂（乙酸乙酯）等。
A、酯化反应液
反应20h



其中，8.843min为原料，18.9min与35.6min均为所要产物，前者为醇酯化物，后者为酚羟基和醇羟基均被酯化，20.4min为酚酯化物（副产物），10-20min之间有一未积分色谱峰为溶剂乙酸乙酯峰。

反应28h



原料的减少量约等于产物的增加量，随着时间延长，单酯化物有向双酯化物转化的趋势，但副反应并没有明显增加。



醇酯化物波长扫描，把上图的峰高与吸光度对照基本一致。

B、酯化反应催化剂不同，引起反应选择性不同，下图为在另一催化剂下组分变化



酚酯化物（副产物）明显增多。C、胺化反应液 按理论，在反相色谱上，化合物胺化后，其极性应增强
酚酯化物（副产物）明显增多。



理论与实际符合，3.6min为醇酯化物的胺化产物；4.9min为双酯化物的胺化物产物，该化合物水解酚酯端成酚羟基，转化成3.6min的胺化物（最终产物）。
酚酯化物（副产物）明显增多。D、酯化产物比例不同，引起水解反应完全的难易程度不同。
酚酯化物（副产物）明显增多。



酚酯化物（副产物）明显增多。



上图　保留时间提前是由于为缩短分析时间而增加了甲醇的比例至38%后的结果醇酯化物：双酯化物＝2.5：1
酚酯化物（副产物）明显增多。下图　醇酯化物：双酯化物≈1：1,大大增加胺化后水解的时间，且水解难以反应完全。反馈的结果是应促进醇酯化物的生成，抑制双酯化物的生成，以此方向来优化反应条件。
酚酯化物（副产物）明显增多。Ｅ、水解反应液
酚酯化物（副产物）明显增多。



水解完全，在5min左右未见明显双酯化的胺化物，6.5min为副反应产物。

Ｆ、反应往负方向进行的例子
a、付克反应液

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2010-1-4 11:57

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2010-1-4 11:57

上下两图仅反应时间不同，下图反应时间长，其中5.223min为原料，21.377min处为所要产物，35.474min处为中间态（开始时被误认为是所要产物）
b、胺化反应液

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2010-1-4 11:58

胺化后，原料峰明显增强，中间态峰消失。反应实际结果与理论不符。

3、保留时间变化　保留时间变化要分析是组分漂移还是有新的组分产生，如果是环境对保留时间时间影响比较大的，也可将其与需要对比的反应液混合以确定是同一个物质还是其它新的物质。

三、        成品阶段
此阶段主要是对提高产品纯度的相关处理，主要方法有萃取，蒸馏，重结晶，过柱等。这一阶段有归一法纯度检测和对照品法含量检测两种情况。
1、        纯度与含量基本一致 这种情况对于我们跟踪分析人员来说是乐于见到的，如果多次结果均一致，则跟踪时以归一法来检测就行，省时，省力。
2、        纯度与含量不一致这种情况基本上是纯度高于含量（常以主成分最大吸收为检测波长）。出现这种现在的可能是：（1）检测波长选择不当，主成分峰的响应强于有关物质的响应，可用自身对照法或引入校正因子的方法来解决，规定校正因子在0.9-1.1范围内的，可用直接归一法；若选择的波长是有关物质响应大于主成分，则可能出现纯度低于含量的现象。（2）测纯度时，进样浓度太低，有些杂质浓度低于检测限而未被检测出，增加进样量可以解决。（3）成品中可能含量不响应的盐类杂质，有机溶剂或水分等。

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2010-1-4 11:58

某化合物归一法含量为99.5%，但按标准以内标法检测，实际含量为98.2%，经与合成人员分析，可能是其中的铵盐没有除尽。（色谱条件：岛津C18柱，50mmol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调PH为3.0）-甲醇-乙腈（55：34：11），检测波长214nm，柱温30℃）

[ 本帖最后由 yfdihdx 于 2010-1-4 11:58 编辑 ]

不错，看看再说！！

难得很好的例子！！！

谢谢楼主，上传这么多图片很不易吧！辛苦了！

成体系，不错，

谢谢楼主，图文的帖子，看起来很清楚！！