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标题:【求助】空肠、回肠、胰腺的β-actin表不表达？

shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-29 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】空肠、回肠、胰腺的β-actin表不表达？


大家好，我最近做某目的蛋白，是关于能量代谢的一个蛋白，由于做的组织较多，其中包括空肠、回肠以及胰腺。目的蛋白的条带都出了，可用β-actin做内参跑western条带时，因为我是一组5个样品，只出了其中三个，做了三次，还以为是一抗孵育、转膜等等其他问题，可是我避免了这些问题后仍然再做发现，我无论如何做，仍然是条带缺失，仍是有一部分没有条带，按理说，抗体应该是敏感性很强的，我组内用的是进口的抗体，没有质量问题。后来我考虑可能因为蛋白降解所以不出条带，我平常都用-20℃的分装的冻存样本，后来我把-80℃的拿出来 又做了次，发现仍然是条带 缺失，空肠，回肠。胰腺的β-actin均是如此，用考马斯染过后，证明确实有蛋白存在膜上，但不知道为什么β-actin总是不出，极其郁闷，想请过来人帮忙解答，谢谢！
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plaa[使用道具]
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发表于 2013-6-29 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗、二抗的稀释度多少？
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发表于 2013-6-29 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

因为你不该用bata-actin作为检测肠组织的内参，因为肠组织属于平滑肌，其actin不是bata型的。你或者换抗体或者换内参，应该就可以解决你的问题。
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发表于 2013-6-29 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 plaa 于 2013-6-29 10:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一抗、二抗的稀释度多少？

一抗 1:2000 二抗 1:2000
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-29 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dragonkilly 于 2013-6-29 10:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

因为你不该用bata-actin作为检测肠组织的内参，因为肠组织属于平滑肌，其actin不是bata型的。你或者换抗体或者换内参，应该就可以解决你的问题。

您好，我弱弱的问一下，我没怎么细看b-actin的说明书，上面貌似只说在心肌、骨骼肌不能用，因b-actin是胞浆蛋白吗，几乎其他组织都表达，而且我还有一点想不明白的是，我的条带是部分缺失，一组5个样，前三个有带，后俩没有，如果b-actin不能用作肠子内参，那为何我还出了一部分呢？是不是我切组织的时候，切到部分不是平滑肌的，所以就表达了部分呢？我查阅了一些文献，发现文献里肠子大都是做免疫组化。免疫荧光等等技术比较多，目前在我实验室，我打听到的还没有人做肠子的western,这个课题是老板订的，我需要拿出充分的依据来说服我老板，所以想请问楼楼是以前做过，还是有什么参考文献抑或是其他可靠的依据可以证明这一点，我目前也在找这方面的依据，我做这个快郁闷了，老板只会挑我实验毛病，一味的叫我做，唉，所以还请楼楼指导，谢谢！
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发表于 2013-6-29 10:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('http://biogps.org/#goto=genereport&id=60')

这里查到的表达量看胰腺和胰岛几乎没有ACTB表达，骨骼肌也没有但是心肌和平滑肌里表达量应该很高。小肠里表达量较低，如果你的样品里面恰好有很多结缔组织的话做不出来也是有可能的。换一个内参吧
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发表于 2013-6-29 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在这个帖子中cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/topic/9669973') 我的大号xray19，及iris_palm战友有过详细的讨论， 你可以看一下。b-actin 作为平滑肌内参可能存在问题，这跟公司抗体制备方法和actin的分型有关（不知道你前三个有条带是什么样子的，淡淡的还是浓粗的？）。如果可能还是尽快换为gapdh内参。仅供参考吧。
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-29 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
糖尿病
我还想问GAPDH是否与糖代谢有关啊？因为我做的目的蛋白和大鼠造模均与糖尿病胰岛素抵抗以及能量代谢有关，会不会干扰？
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发表于 2013-6-29 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
糖尿病
GAPDH参与糖酵解，但糖尿病胰岛抵抗模型是否影响GAPDH表达，这个我也说不准，但私下个人以为是没有太大影响的。但你最好先查看下文献，以便应对将来投文章审稿人的质疑。如果，gapdh不行的话，考虑tublin？
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-6-29 10:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
GAPDH参与糖酵解，但糖尿病胰岛抵抗模型是否影响GAPDH表达，这个我也说不准，但私下个人以为是没有太大影响的。但你最好先查看下文献，以便应对将来投文章审稿人的质疑。如果，gapdh不行的话，考虑tublin？

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你好，我做的目的蛋白是丙酮酸脱氢酶复合体PDH，是丙酮酸氧化脱羧反应的关键酶，也是胰岛素信号通路下的一个分子，目前我只查阅到这个分子在心肌和骨骼肌的论述，带有条带的文章还没查到，其他组织的更是没有，我不求发文章啊，这只是我的硕士毕业课题，学校15号放假，我年前做不完啦，唉，就这b-actin不出，目的蛋白已出。目前组内还没有其他内参可用，我们组就有一瓶b-actin哭死我了 老板坑死我了 谢谢楼楼指导啊 我决定明天和老板去谈判
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