小中大转膜:
跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.
另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右(有次着急只晃了10分钟,结果也挺好的)。开始用的PVDF膜, 0.45um, 用国产的MARKER后,总是染的不清楚, 而且无论时间长短, 最后一块滤纸都会被染色. 后来换了NEB后,PVDF也不容易上色(可能和PVDF的质量有关,我买的虽然也是MILLIPORE,但好像比较便宜20CM*10CM才50块钱). 丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色,不知道有没有影响。后来换成NC膜,0.22um ,效果挺好的,MARKER易染上,丽春红也易着色,还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。
不同转膜仪和电源转膜的条件不同,我用的是BIO-RAD 的半干转(电压不过25V的那款),电源是BIO-RAD的PC200,70KD的我转50分钟,20V,17KD的转20V,30分钟左右,条件不是很稳定,有时半路打开盖子看看MARKER转的情况,但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流,说1.2-2MA/CM2我看了一下,我的胶大约都是5*3左右大的,20V一般电流会是60-30MA之间,要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚.
如果用PVDF膜,先用甲醇浸泡一段时间,我一般是5分钟,但也有人说不过30秒,不清楚。换了NC膜就直接放入转移缓冲液中的,晃30分钟左右。
滤纸开始是买的那种专用滤纸,上面三张,下面三张,后来有人说这种滤纸是做湿转用的,应当用那种比较厚的,上下各一张,我也不知道,后来就换成普通滤纸了,上下大约各15张左右,有时着急还反复用过,效果也还可以,估计问题不大。
因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路,所以一般滤纸》膜》胶. 他们之间一定不要有气泡.。膜上要做好标记,识别正反面和上下,切个小角是常用的方法, 有MARKER也方便记.
转膜后的胶可用考染看看转膜情况.
考马斯亮蓝R250: R250 0.25克, 甲醇50ML, 冰乙酸40ML, 加水到100ML.
脱色液: 乙酸 50ML, 甲醇225ML(可用乙醇), ddH2O500ML
10*丽春红(20ML): 2%丽春红(0.4克), 30%三氯乙酸(6克), 30%磺基水杨酸(6克). 用时加入9 倍的ddH2O
10*转膜缓冲液:
70KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, SDS 1.85克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加20ML 甲醇, 加70ML 双蒸水
17KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加50ML 甲醇, 加40ML 双蒸水
封闭:
用5%的封闭液(伊利的高钙脱脂), 室温,摇床1小时.
5%封闭液: 1克脱脂奶粉, 20ML洗膜液.
洗膜液: 10*PBS 50ML, 450ML ddH2O, 0.5ML TWEEN-20
抗体孵育:
将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)
一抗:用杂交液配置.浓度可根据点蛋白实验,及ECL要求来定.
4度,过夜.最好有那种4度摇床.我一般早上到实验室后,再摇床上再摇3个小时左右.
洗膜液洗3次,每次10分钟.
二抗: 用杂交液配置.室温,摇床,1小时.
洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.
如果一抗没有混浊,放置时间不长,可以重复使用,本人一般连作二天时,才会重复用,如果因为一抗的原因而不出结果,太不值了.
杂交液: BSA0.5克, 洗膜液50ML.4度保存,如有混浊,重配.
点蛋白试验:
在正式作WESTERN之前可先做这个,如果没有结果可能提蛋白中不含目的蛋白,也可能一抗与目的蛋白结合不好,或一,二抗结合不好.(之前拿一滴二抗和ECL试一下是否发光,以排除二抗的问题).若有结果,可能选择一个比较合适的一,二抗浓度.
取小块膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去. 加不同浓度一抗,2-3小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.不同浓度二抗一小时, 室温,摇床. 洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.显色
ECL显影
将膜上多余的水吸干,与胶相邻的一面向上,按ECL说明书配置发光液.点在膜上.
不同厂家ECL要求不一样,本人用的ECL二种液体1:1混合后,0.125/CM2, 放置2分钟,吸干(可以用微量加样器抽回来,可连续用下一张膜),放在保鲜膜上,包好,压片.
若肉眼可见发光,可压10-20秒; 若看不到,可压30分钟.(再长的时间没试过,一般30分钟不出,就重新再回一次ECL,重做一次,若再不出,就认为没有了.)
转完膜后的膜如果不能及时做,可放在洗膜液中,4度保存,最多放过2天,时间长了就不知道了.