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标题:【求助】蛋白质测序转PVDF膜的问题

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白质测序转PVDF膜的问题


我的蛋白分子量在20KD左右，跑Tricine--sds-PAGE（1.5mm gel)电泳后转PVDF膜,预染Marker都在膜上，按理说应该没有把样品转出去，可是用考马斯亮染就是染不出样品，Marker到能染上。请较各位前辈，这会是什么原因造成的？急。。。。在线等待
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mysmdbl[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没必要用小分子胶来分析这个蛋白，13%的胶就可以了。你搞的太复杂了！！！！简单的事情别搞的复杂，搞的自己精疲力尽！！
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发表于 2013-7-3 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也可以试试质谱法测序，N端C端都可测，而且样品准备比较简单
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PVDF膜是多大孔径的？20KD左右得很容易穿过0.45um膜的
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没必要用小分子胶来分析这个蛋白，13%的胶就可以了。你搞的太复杂了！！！！简单的事情别搞的复杂，搞的自己精疲力尽！！

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SDS--PAGE电泳跑过，效果不好，才选用小分子胶来分析。小分子胶不好转吗？？
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PVDF膜是多大孔径的？20KD左右得很容易穿过0.45um膜的

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我用的是0.45um膜，今天试试0.22um的看行不行。150MA 2小时这个条件应该不会把蛋白转出去吧？
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www.1[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该150MA 45分钟到1小时
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nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 www.1 于 2013-7-3 15:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

应该150MA 45分钟到1小时

我试了下这个条件，样品没转上。这个蛋白真的好折腾人。
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发表于 2013-7-3 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能够保证转印的过程低温呢？比如拿个盆，放一些水，再放几个冰袋，再把转印仪放在水里。
我记得以前用的转印仪程序设置是，恒流110 mA，电压大概是70 V。时间是45 min----1 h。
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道楼主做出来没有，我的蛋白是12k，用16.5%的普通胶跑，转膜的话100v，35-40min左右就有条带，用的就是最普通的PVDF膜，估计是条件没有摸好，应该跟胶和膜没有关系。我的也是摸了很久的条件。
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