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标题:【求助】免疫沉淀沉淀不完全

莓菓333[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】免疫沉淀沉淀不完全


我做免疫共沉淀，沉淀HSP90发现沉淀很不完全。蛋白大部分还留在上清中，沉淀中的很少。我用的是RIPA裂解液，250ug总蛋白用了2ug抗体，加入抗体后在4度缓慢摇晃24h，后又加入珠子4度缓慢摇晃过夜。请问各位大侠问题在哪里？谢过了先！
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popo520[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个抗体可以进行IP？
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莓菓333[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 popo520 于 2013-7-3 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个抗体可以进行IP？

可以的，说明书上说可以进行IP
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popo520[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
沉淀后的检测实验是怎么设计的？
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发表于 2013-7-3 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
沉淀后的上清取出，跑电泳，珠子用RIPA裂解液洗两次后加入适量裂解液及Loadingbuffer，95度煮5min，然后跑电泳，转膜后用HSP90的一抗杂，上清中的蛋白量远比沉淀中的多。不知这样有错没
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 小中大

What isotype of your antibody? Did you check the beads fit the antibody isotype or not?
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发表于 2013-7-3 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

珠子用哪里的？
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莓菓333[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 NBA 于 2013-7-3 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

珠子用哪里的？

isotype是rat IgG2a，珠子与它的isotype 是适合的。愁死了，会是什么问题呢？
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bling[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Modify the cell lyses buffer as following :

50mM Tris HCl pH 7.5

150 mM NaCl

1% Triton X-100

add proteinase inhibitors freshly
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vera+[使用道具]
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发表于 2013-7-3 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大多数情况是抗体或者珠子原因
自身的话 1 lysis是否可以用NP-40
一抗过夜孵育 珠子3h以上
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