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标题:【求助】多肽的质谱结果解析

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发表于 2013-7-5 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】多肽的质谱结果解析

各位大侠 我的蛋白一级序列清楚 将其酶解后取得酶解产物，经过凝胶层析和制备液相两步分离后 经过活性筛选 选择了制备液相显示是单峰的一个组分 用分析液相分析大约显示3个主峰 对该部分分别打了MALDI-TOF 和HPLC-MS-MS 问题1：两个仪器出来的结果对肽段分子量分析结果差别很大 到底以那个为准？
2：由于样品有限没有办法继续分离了 又不是很纯 没有办法做氨基酸序列分析，请问这两种方法（或其中一种）得到的结果怎么能通过软件分析得到肽段对应的是蛋白的那一段序列呢（很着急 请多多帮助 先多谢了啊）？
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发表于 2013-7-5 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先MALDI-TOF-MS/MS分析酶解产物不需要纯化。
两个仪器出来的结果对肽段分子量分析结果差别很大。这个问题可能是你仪器没有校正，尤其是MALDI。
由于样品有限没有办法继续分离了 又不是很纯 没有办法做氨基酸序列分析，请问这两种方法（或其中一种）得到的结果怎么能通过软件分析得到肽段对应的是蛋白的那一段序列呢（很着急 请多多帮助 先多谢了啊）？把你的二级质谱数据上网搜库就行。
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发表于 2013-7-5 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢啊 不知道是哪个二级质谱数据库 我刚开始做 对该体系不是很了解 还望不厌其烦 多谢了
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发表于 2013-7-5 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 你说的nMALDI和LC-ESI-MSMS分子量不一样，是正常的，MALDI上肽是单电荷，将质荷比减去1就是肽的分子量，ESI上肽会带2个或3个电荷，分子量应该是质荷比乘以2或3再减去2或3.你方便的话可以把质谱图贴上来给你看看。
2. 无论MALDI还是ESI应该主峰是一样的（看分子量，不是质谱图上的质荷比），然后要选择出来做二级，通过二级质谱就可以推断其系列。或者你可以参考楼上说的做个数据库检索就知道了。
3.你把问题弄复杂化了，最简单的方法是跑SDS-PAGE，然后把目标条带切下来做酶解，上MALDI做一级质谱（肽指纹谱），然后将这个蛋白的序列做理论酶解和MALDI测出来的一级图进行匹配，看质谱出来的是不是你的目标蛋白。网上有专门的工具来计算一个蛋白质的理论酶解肽，SwissProt上有。
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发表于 2013-7-5 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
3.跑SDS-PAGE 我跑过 分子量小于10KD 的基本上没分开 再者 条带比较多 另外 分子量较小的是否就无法鉴定了呢 下面我把我的谱图上传 请帮助分析一下 非常感谢啊
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发表于 2013-7-5 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你不是说你的蛋白一级序列你知道吗，那你从条带上找相应位置的蛋白，切下来酶解，在做LC-MSMS啊。
我看了你的质谱图，MALDI的是只做了线性分子量，并没有MSMS，又加上你的蛋白不是纯的，所以不好从图上看出什么信息的。ESI的质谱图做了一级和二级，那你就利用MSMS做下数据库检索，看能匹配到你的蛋白不。
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发表于 2013-7-5 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的MALDI和LC-MS/MS都是在外面做的，如果把条带切下来酶解，再做LC-MSMS可能也得不少银子吧 呵呵 我会马上试着按你说的用数据库检索的 多谢你的建议 短短两句话就能感觉到你的思维好有调理性 很佩服啊
另，恳请高人不知可否往我邮箱或qq留个联系方式给我 还有序列检索的一些问题想请教你 真的非常感谢啊
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发表于 2013-7-5 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从MALDI上来看 酶解的片段还是挺长的，要鉴定其准确的序列具有一定的难度，不知道你用的是什么酶？ 我说点我自己的看法：1.我看的要解的是活性部分的序列，这当然最好要将活性的的单体纯化至90%以上再进行序列的鉴定。在质谱上你虽然看到几个分子离子峰，但其实你并不知道活性的是哪一个！ 2.将活性的成分纯化出来后，再像楼上那位同学说的做酶解，搜库的方法，但是这里要提醒你一下：搜库的方法是基于你的样品在数据库里面有的蛋白序列，否则你是鉴定不出来的！若搜不出什么蛋白，那你的活性蛋白就是新的蛋白，好好鉴定吧，可以为全世界的蛋白库做一点小贡献，呵呵！ 在这里想说一句，要鉴定一个未知的蛋白或多肽的准确序列，不花点时间是很难测出来滴！
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2013-7-5 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白是已知序列的现在正想办法纯化 但是苦于得到做MALDI的产物已经只有微微20、30mg 不知道后续该如何纯化了 另外请教搜库的方法 具体用哪个库呢 我只知道大家都用Swiss-Prot 但是这个软件功能太强大具体用里面的小库来查呢 还请多多指教！
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发表于 2013-7-5 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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其中MS/MS Ion Search 是用二级质谱搜索的
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