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标题:【求助】about TAP(蛋白相互作用)

bgf5[使用道具]
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【求助】about TAP(蛋白相互作用)


请教前辈们,最近本人从《生物化学与生物物理学进展》(2004;31(4),379-384)上看到一篇新技术讲座――《串连亲和纯化(TAP)技术在蛋白组学中的应用》,对于前面介绍的TAP新方法很感兴趣。希望能够利用该方法来筛选与我的兴趣蛋白相互作用的蛋白,但是有一个问题在这里向大家请教一下。
我的兴趣蛋白是一个分泌型的糖蛋白,也就是说它是经过修饰加工,穿膜,切断信号肽后细胞外发挥作用的。我注意到介绍该方法的文章,主要应用成功例子是筛选酵母和果蝇细胞中的蛋白复合体,那么不知该方法是否可以用于我的分泌型糖蛋白的相互作用研究呢?
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mamamiya[使用道具]
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应该可以的,原则上说TAP所连的基因是可以转到培养的动物细胞中,所以其表达的蛋白理论上是能经过修饰加工的;在哺乳动物细胞中也有成功报道,可以到网上搜搜看,methods可能就有,园子里也有相关连接。我也想做的,但老板不同意,怕冒风险,所以不肯出钱买载体,让我自行解决,很遗憾呀!
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应该可以的,原则上说TAP所连的基因是可以转到培养的动物细胞中,所以其表达的蛋白理论上是能经过修饰加工的;在哺乳动物细胞中也有成功报道,可以到网上搜搜看,methods可能就有,园子里也有相关连接。我也想做的,但老板不同意,怕冒风险,所以不肯出钱买载体,让我自行解决,很遗憾呀!

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前辈,谢谢指点:)
可我还有一个问题不很清楚。我的蛋白是分泌型的,也就意味着其可能是在细胞外发挥作用的,相互作用的蛋白或受体也应该是细胞外结合的吧。那么,应用TAP筛选到细胞内结合的相互作用蛋白还有意义吗?
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个人认为首先做个不同阶段蛋白定位研究,如果您的蛋白均在细胞外,而且转运途径也很清楚,那么我想还是换个研究方法吧,如GST PULL DOWN.
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个人认为首先做个不同阶段蛋白定位研究,如果您的蛋白均在细胞外,而且转运途径也很清楚,那么我想还是换个研究方法吧,如GST PULL DOWN.

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前辈,谢谢指点。请问如果要做不同阶段蛋白定位研究的话,那应该大致分为哪几个阶段,并且采用什么手段呢?
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kswl870[使用道具]
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能否上传《生物化学与生物物理学进展》(2004;31(4),379-384)上看到一篇新技术讲座――《串连亲和纯化(TAP)技术在蛋白组学中的应用》,我想学习一下。谢谢。
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kswl870[使用道具]
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蛋白定位研究首先应该考虑你所要研究的蛋白的可能作用和分类,比如细胞周期蛋白,就得做细胞的同步化,如果细胞培养有特殊条件,比如低氧或低糖等等,就需做time course.有条件的话最好用激光共焦扫描仪,国外高点文章都这莫做的 。
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蛋白定位研究首先应该考虑你所要研究的蛋白的可能作用和分类,比如细胞周期蛋白,就得做细胞的同步化,如果细胞培养有特殊条件,比如低氧或低糖等等,就需做time course.有条件的话最好用激光共焦扫描仪,国外高点文章都这莫做的 。

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嗯,我也看到好多用激光共聚焦来做蛋白定位的。我的蛋白是在癌旁组织中表达丰富,且具有特异性抑制内皮细胞增殖的作用。
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bgf5[使用道具]
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谢谢已经下载了。你研究的可是胞外分泌型蛋白?我认为应首先确定靶器官,然后再看该蛋白在靶细胞的定位,可以构建C端GFP融合表达载体,激光共焦还是可用的。如果想动态观察蛋白的合成、分泌和作用,恐怕就得用荧光相干光谱了。据说激光共焦也有倒置功能的,我不太清楚。
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谈谈关于构建好的TAP克隆表达状况的检测方法:
构建好的克隆在进行下一步的实验时需要先进行小量表达检测蛋白的表达状况,如果有针对目的蛋白的特异性抗体当然最好,如果没有也可以借助TAP标签的组成特点,即带有两个串联的IgG结合结构域,这样使用不相关的抗体作为一抗,如果有大小正确的条带显示就证明蛋白有表达。这个方法很有效,我用鼠抗和兔抗都作过,均可得到较好的效果。进行这方面实验的战友如有需要不妨试试。
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