蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】15%PAGE电泳考染和转膜后染膜17KD以下蛋白不明显？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 19  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】15%PAGE电泳考染和转膜后染膜17KD以下蛋白不明显？

sunshine039[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74211
精华 0
积分 253
帖子 205
信誉分 100
可用分 1821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
1

发表于 2013-7-6 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】15%PAGE电泳考染和转膜后染膜17KD以下蛋白不明显？

最近在做小分子17KD蛋白，电泳和转膜后未见明显小分子蛋白，附上转膜后立春红染色图片一张，图中17kd到10kd相应位置的蛋白少，似弥散，模糊不明。考染后蛋白分布也是这样（未附图）。请大家给点意见。急！


查看积分策略说明
附件
2013-7-6 15:21
92413671.jpg (49.15 KB)
 
顶部
shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
2

发表于 2013-7-6 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的电泳的电压是多少，电压大或者电泳时间长容易把小分子蛋白弥散了
顶部
sunshine039[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74211
精华 0
积分 253
帖子 205
信誉分 100
可用分 1821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
3

发表于 2013-7-6 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的六一的电泳槽，100V恒压2.5h。这是新跑的一张。做了两个月了，目的蛋白都没有结果，心里着急啊，希望大家指点一下。


查看积分策略说明
附件
2013-7-6 15:23
36332496.jpg (51.69 KB)
 
顶部
mysmdbl[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77053
精华 0
积分 314
帖子 327
信誉分 100
可用分 2446
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
4

发表于 2013-7-6 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
时间长了 半小时左右可以了
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2013-7-6 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是用六一的，一般是225ma，2h。从你的立春红染色来看，没有转移成功，不知道你的上样量多少。建议是做个梯度上样量，用我这个条件试一试
顶部
sunshine039[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74211
精华 0
积分 253
帖子 205
信誉分 100
可用分 1821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
6

发表于 2013-7-6 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问一下，你的225mA，2h是电泳时间？也是小分子的蛋白么？六一的转膜槽小分子用的什么条件，我用的20V过夜。
内参曝光都没有问题，就是17KD的目的蛋白出不来。
顶部
wu11998866[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73743
精华 0
积分 569
帖子 797
信誉分 100
可用分 4850
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-27
状态 离线
7

发表于 2013-7-6 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白是12KD的，电泳100v 2.5h，蛋白会不会弥散啊，还有对于这么小分子量的蛋白转膜的时候有什么要注意的吗，我用的是PDVF膜，20v 20min，会不会把我要的蛋白转走了啊？最近几次都没做出来 很急！
顶部
sunshine039[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74211
精华 0
积分 253
帖子 205
信誉分 100
可用分 1821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
8

发表于 2013-7-6 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用20V20min转膜，这么短时间，蛋白能转过来么？立春红染色有蛋白么？
顶部
langlang[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77033
精华 0
积分 668
帖子 976
信誉分 100
可用分 5741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
9

发表于 2013-7-6 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
染胶发现条带弥撒的，说明电泳条件不太好。我是过跑十几KD的蛋白，12％PAGE的条带反而比15%的清晰，你可以试试。
顶部
TAT[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74236
精华 0
积分 507
帖子 694
信誉分 100
可用分 4298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
10

发表于 2013-7-6 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

所用的转膜仪器不同 时间不一样也很正常 Bio-rad就只需要20分钟

可以试试不转膜 只染胶 这样可以确定是转膜前还是转膜后的问题 转膜前就要考虑蛋白量、电泳液等的问题 转膜后就是转膜时间、凝胶三明治制作的问题了

WB就是这样 只能慢慢摸条件了 淡定
顶部
 19  1/2 12››