小中大(2)竞争法
在竞争法ELISA中,阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物
的浓度和加入竞争抑制物的量,一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间,此时反应最为
敏感。
竞争法ELISA不易用自视判断结果,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差
异,一般均用比色计测定,读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种,即阳性判定
值法和抑制率法。
a. 阳性判定值法
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同,但在计算公式中引入阳性对照A值,
现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆,阳
性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值
后,先计算阴性对照A值的平均值(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX),两个平均数
的差(N-P)必须大于一个特定的数值(例如0.300),试验才有效。3个阴性对照A值均应
小于2.000,而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范围,则弃去,而以另
2个阴性对照重新计算×NCX;如有2个阴性对照A超出以上范围,则该次实验无效。阳性
判定值按下式计算:
阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
标本A值≤阳性判定值的反应为阳性,A>阳性判定值的反应为阴性。
b. 抑制率法
抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度,按下式计算:
抑制率(%)= (阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照A值
一般规定抑制率≥50%为阳性,<50%为阴性。
4.7.2 定量测定
ELSIA操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别是固相载体的包被难达到各个体之间
的一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件
下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA,标准曲线的范围一般较宽,曲线最
高点的吸光度可接近2.0,绘制时常用半对数纸,以检测物的浓度为横坐标,以吸光度为
纵坐标,将各浓度的值逐点连接,所得曲线一般呈S形,其头、尾部曲线趋于平坦,中央
较呈直线的部分是最理想的检测区域。甲胎蛋白质ELISA测定的标准曲线示例见图4-1。
测定小分子量物质常用竞争法(参见2.2),其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度
呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线
示例见图4-2。注意图中横坐标为对数关系,这更有利于测定系统的表达。