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标题:【求助】SDS-PAGE上样量问题

12xunmei[使用道具]
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发表于 2013-7-10 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE上样量问题

想做做单向SDS-PAGE，用的是伯乐的Protean II xi Cell大电泳仪，梳子为15个齿的，请问上样量大概要多少ug？多少ul呢？刚看了Instrument Manual没找到答案，期待解答！
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dog002[使用道具]
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发表于 2013-7-10 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做单向话每个上样孔上50ug的蛋白就可以了，上样的最大体积数和你的垫片厚度以及梳子大小有关系，不过尽量不要加太满不然就容易扩散了，所以你的蛋白浓度浓的话是可以用2×上样buffer，如果比较稀的话就要用5×上样buffer。另外如果你的泳道有空的话最好也加上相同的上样buffer，条带就不容易跑歪了。
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12xunmei[使用道具]
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发表于 2013-7-10 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，谢谢
忘了说了，我要做考染，是大的电泳仪，50ug就够了吗？
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发表于 2013-7-10 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样的蛋白总量应不使电泳条带发生变形，一般不应超过30ug/mm2（应该是平方毫米，不知道怎么把角标弄上去）载荷面，比如150ug相当于5mmx1mm的胶槽。你可以根据你的凝胶面积和梳子的大小计算一下每个孔的上样量。
在做之前最好测一下蛋白浓度！
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-7-10 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下，上样之前测蛋白浓度用哪种方法最好啊？是考马斯亮蓝法还是直接280nm紫外测定啊！我前几天用280nm紫外测的，根据测定结果按照每个上样孔100ug点样可基本上没有蛋白显带，蛋白的量还是不够啊？为什么？
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发表于 2013-7-10 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
考马斯亮蓝法好于直接280紫外测定，我觉得。
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发表于 2013-7-10 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
考马斯亮蓝比较精确，适合微量的
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-7-10 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我建议你在准备样品时,在每个样品里加5微升5摩尔氯化钠.我一般是考马斯亮篮染加10微克蛋白,印染加5微克蛋白就足够了.
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发表于 2013-7-10 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想知道加氯化钠的原因是什么啊？点样和测定蛋白质浓度时都加吗？
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发表于 2013-7-10 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在作SDS-PAGE电泳时做过对照，上同样的量，加了Nacl的就是清楚，加Nacl只是作电泳处理样时加，测定蛋白质浓度不用加。
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