蛋白质与蛋白组学

各位大侠９９偶吧！
　本人暑假在四十几度高温条件下做ＷＢ．组织蛋白上样每孔２００ug，大约２０ul/孔，电泳８０Ｖ跑出浓缩胶，１００Ｖ分离胶至底部，切胶约３＊７ＣＭ２，伯乐半干转膜仪（２５０Ｖ／３．０Ａ／３００Ｗ），目的蛋白３８ＫＤ，３０ＭＡ恒流转１６０分钟，用的ＰＶＤＦ膜是师兄留下来的，也不知道是哪个公司产的，ＤＡＢ显色，效果还不错．
　现在分别用了millipore和北京中杉的ＰＶＤＦ膜，孔径是０．４５um,同样的条件做不出来了，每次转膜后都发现膜很花，怀疑是有短路电压过高所致（超过了２５Ｖ），封闭以及一抗二抗杂交后膜不花了，但是ＤＡＢ显色又全花了，目的蛋白出不来．现提出几点疑问，望好心人帮忙解答：
　１，恒流转膜和恒压转哪个效果好些，我们实验室的仪器不能超过２５Ｖ，有没有用伯乐半干转膜仪做过ＷＢ的大虾，４０ＫＤ左右蛋白转膜条件求助！
　２，膜花的原因是什么？并且感觉膜比以前用的要薄，会不会３０ＭＡ恒流转１６０分钟将目的蛋白转过了？
　３，偶还要做培养细胞的蛋白，每孔上样４０ug够了吗？

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对不起，我当时写错了，转膜时电流应该是300MA！由此给大家带来的不便，深表歉意！

各位大侠９９偶吧！
　本人暑假在四十几度高温条件下做ＷＢ．组织蛋白上样每孔２００ug，大约２０ul/孔，电泳８０Ｖ跑出浓缩胶，１００Ｖ分离胶至底部，切胶约３＊７ＣＭ２，伯乐半干转膜仪（２５０Ｖ／３．０Ａ／３００Ｗ），目的蛋白３８ＫＤ，３０ＭＡ恒流转１６０分钟，用的ＰＶＤＦ膜是师兄留下来的，也不知道是哪个公司产的，ＤＡＢ显色，效果还不错．
　现在分别用了millipore和北京中杉的ＰＶＤＦ膜，孔径是０．４５um,同样的条件做不出来了，每次转膜后都发现膜很花，怀疑是有短路电压过高所致（超过了２５Ｖ），封闭以及一抗二抗杂交后膜不花了，但是ＤＡＢ显色又全花了，目的蛋白出不来．现提出几点疑问，望好心人帮忙解答：
　１，恒流转膜和恒压转哪个效果好些，我们实验室的仪器不能超过２５Ｖ，有没有用伯乐半干转膜仪做过ＷＢ的大虾，４０ＫＤ左右蛋白转膜条件求助！
　２，膜花的原因是什么？并且感觉膜比以前用的要薄，会不会３０ＭＡ恒流转１６０分钟将目的蛋白转过了？
　３，偶还要做培养细胞的蛋白，每孔上样４０ug够了吗？

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说说我们的做法
1，就个人意见我觉得恒压转膜的效果更好一点，我们用的方法是100V恒压转膜3小时，但全程注意降温，因为会产生很多热量。
2，蛋白一般是不会转过的，膜先用甲醇泡10s左右，注意洗膜和封闭，牛奶要好，我们用的是光明的脱脂奶
3，细胞裂解液每孔上40ug足够了！

祝你好运！