小中大
我们实验室目前在做氯化铯密度梯度离心纯化腺病毒。腺病毒纯化分三个步骤：
1．不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒。2．连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。3．透析去除氯化铯（去盐）
我们用的贝克曼的超速离心机和SW28的转子及适用的离心管。首先在离心管中缓慢加入8ml 1.4g/ml氯化铯，再非常轻缓地加入6ml 1.2g/ml氯化铯。病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。所以加的时候一定要特别缓慢。为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3×108细胞。超净台中在不连续梯度顶部加入20ml DMEM5%病毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用PH 7.9 10mM Tris-HCL调至20ml。用SW28转子，23000rpw4°离心90min。这时候会看到两条带，下面一条带是病毒带，上面一条带是杂质蛋白。小心抽出病毒带，加入1倍体积1×TE，这一步对于把溶液密度降低至1.2以下是必须的，病毒带的密度大约为1.345。将12ml 1.4g/ml和14ml 1.2g/ml氯化铯连续密度梯度加入离心管中。非常缓慢地在密度梯度顶部加入8-10ml稀释的病毒悬液。23000rpw 4℃离心16-20小时。小心抽出病毒带。再经过透析，就可以把病毒纯化好了。
做密度梯度离心的时候，一定要注意不要刹车。当初我实验室的师兄就是因为开了刹车，导致那次病毒纯化失败。做一次氯化铯密度梯度离心纯化腺病毒的实验耗费巨大，一次极小的失误就可能导致全盘失败，所以我每次做都很谨慎。配氯化铯梯度很累，一定要中午吃饱饭后开始做，确保有体力，要保证手不发抖。这个有点难度，因为加的慢，时间久了，手会很酸的。在当天下午快做好第一次离心的时候，就开始配第二次离心的梯度，不开刹车会停的好慢的，23000转大概要停一个小时。晚饭前开始第二次离心，把握好时间，在第二天下午结束离心，开始用蔗糖溶液进行三次透析。注意蔗糖的透析液要留一部分。用来作为紫外分光光度计测病毒浓度的对照。每次如果做的好的话，可以得到5毫升左右的高滴度的腺病毒，这是非常宝贵的资源，看着自己做出来的腺病毒，很有成就感的。
