【求助】SDS-PAGE的一些相关问题

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标题:【求助】SDS-PAGE的一些相关问题

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2013-7-16 13:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我已经跑了快一个月的垂直电泳了,但总是存在这样或那样的问题,现列举出来,还请各位师兄师姐们帮忙.(我们老板说了,如果我在下个月底能把胶跑好了,就请我吃饭,这不是看不起人吗)
我是从手术中获得的关节滑膜组织,置于液氮中冻存,临用前,取约1-2g组织,在液氮下研磨成粉状,然后加2mlPBS(PH7.4),在玻璃匀浆器中以中速匀浆(冰上操作),3000rpm,4度离心15min,收集上清后,用BCA法测蛋白浓度为30mg/ml.然后,用PBS加5倍loading buffer将样品稀释成10ug/ul,在沸水中煮3min ,3000 rpm离心,5分钟,取上清,上样(50,80,100,120,150ug /孔).150-200V电泳约50分钟左右.考染.
采用12%的分离胶和5%的浓缩胶.
结果及问题:
1.溴芬兰不能完全压成一细线
2.溴芬兰各条带不能跑成一水平直线
3.采用六一厂的电泳系统, 在制完胶后,两个玻板之间进气泡,不能完全去除
4.制完分离胶后用水封,胶凝后,胶面不是一个直线,而是略向上鼓起
5.考染后发现两个边孔的条带出现"微笑"
6.各样品之间的条带相互扩散,各跑道不能清楚的分开
7.各跑道宽窄不一,一般是上面窄,越向下越宽,但有时到胶底时又变窄.(是否和玻板与胶之间进了气有关)
8.在各个横向条带中有竖向的条带
9.我在考染前从不固定,直接从电泳中选出胶后扔进染色液中,这样好不好?
10.各浓度之间没有太大差别,是不是我的样品太浓了.另外向我这样从组织匀浆中直接上样电泳行不行,需不需要对样品进行一下处理.
11.我的电泳条带很多,是不是有很多的杂带啊,怎么处理样品才能去杂带?
12.我想问一下我的样品中存在盐浓度太高的问题?怎么才能去盐?
我现在被这些问题困扰着,请大家为我解决一下.多谢!

[ 本帖最后由 dragonkilly 于 2013-7-16 18:02 编辑 ]

Ao7[使用道具]
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发表于 2013-7-16 13:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dragonkilly 于 2013-7-16 13:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我已经跑了快一个月的垂直电泳了,但总是存在这样或那样的问题,现列举出来,还请各位师兄师姐们帮忙.(我们老板说了,如果我在下个月底能把胶跑好了,就请我吃饭,这不是看不起人吗)
我是从手术中获得的关节滑膜组织,置于 ...

看看这个会有帮助：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4836097&sty=1')

cocacola[使用道具]
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发表于 2013-7-16 13:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

1、电压有点大了，降低在浓缩胶中的电泳电压，改用5-8V/cm×板的垂直长度。上样Buffer中甘油浓度不可过大，对样品浓缩有影响。
2、与你底部有气泡或凝胶凝固不均匀有关。
3、用注射器向两板之间注水，排除气泡。
4、加水封时，动作要轻，并多点添加，尽可能不要冲坏胶面。
5、边缘的凝胶与中间的凝胶凝固不均匀所致，待充分凝固再做。
6、加样要小心，不要漫过孔，可导致样品彼此相混；或样品中蛋白浓度过大，涨破凝胶，导致彼此扩散。不能清楚分开与你的分离胶浓度和电泳缓冲液有关，适当调整。
7、也就是条带呈纺锤形，与你上样量过大有关。
8、条带中出现纹理现象，你的匀浆加样前离心速度过小，提高速度，5000rpm以上3min，（如果效果不好再加大速度）取上清。
9、没有问题。不过适当延长染色时间，比如过夜。
10、是的，蛋白含量至关重要。可以直接用匀浆电泳，但要离心除去不融物，5000rpm以上，离心。且需加上样buffer。
11、看你的试验目的是什么，如果需要很纯的话，就是蛋白纯化了。方法有很多，可到园子里找一下。
12、透析除盐，你可根据你的目的蛋白的分子量大小，选用合适的透析袋，透析除盐。

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发表于 2013-7-16 13:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

电压确实大了点，电压问题同楼上建议；溴酚兰不能压成一细线，注意溴酚兰不要加太多，它只是指示剂，能指示电泳的位置就行了，另外一种情况是你浓缩胶太短了，可能使你的蛋白浓缩不够充分就进分离胶了；溴酚兰不成一条直线和微笑，要注意最外的两个孔最好不要上样，当然，楼上说的胶凝固不均的问题也是可能的；胶里有气泡，可能是你的胶凝固太快造成的，降低AP和TEMED用量，控制胶凝固时间在1h左右，这样就不会有这个问题了；条带相互扩散就是你上样的蛋白量太大啦，减少上样量就可以了；条带多不代表杂带多啊，有的就是蛋白多，你可以看一下相关的文献，看看别人的材料是什么样的，你提的应该是可溶性蛋白；横条中有竖带说明你的样品有很多不溶的东西，要提高离心力；考染不固定也没什么，我跑SDS-PAGE染色从来不固定，没有什么问题，新配的染液染个把钟头就可以了，胶变蓝色就行了，不一定要过夜染，那样会使脱色变得很麻烦；宽窄不一的问题，就你的描述来看，可能还是你的样品上样量太大，而且你的样品分子量处于中间的比较多，所以会出现这种情况；各浓度间没区别，就更说明你上样量太大了（主要是你的样品蛋白浓度太高）；要脱盐可以透析也可以超滤，超滤快一些，可是贵，透析慢，一般要过夜，而且缓冲液要很多，但便宜，你可以自己选择。如果你电泳的时候用的是24D的电泳槽，放入内槽的时候要注意两块板的底部不要夹有气泡，可以用倾斜放入的方法赶出气泡，电泳后如果发现泡没赶干净的话，再赶就不容易了，因为SDS-PAGE的电泳缓冲液里本身就有SDS，里面很多泡的。

kswl870[使用道具]
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发表于 2013-7-16 13:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

师兄师姐，我在进行活性蛋白质电泳时有些疑问与困难：
1.灌胶时没有气泡，但聚合以后，发现在胶与玻璃板之间有气泡，如何处理呢？
2.分离胶，浓缩胶的聚合时间一般各是多少？可否放在37度烘箱中加速聚合？
3.蛋白质在样品处理时失活，是煮沸失活的，难道真的可以复性？

owanaka[使用道具]
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发表于 2013-7-16 13:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我电泳做的也不多，一下仅供参考！
1。灌胶时没有气泡，但聚合以后，发现在胶与玻璃板之间有气泡
这个我做浓缩胶时也遇见过，只要胶没有气泡应该就没事，有气泡可能是分离胶的水封层倒出后玻板有残留的水。
2。分离胶的聚合时间一般要保证1.5h以上，浓缩胶半小时以上应该就没事了。一般不在烘箱中加速聚合，如果想加速，可以适当的加大AP和TEMED的量。
3。复性很难的，只是处理的时间长了，结合在蛋白上的SDS会丢失一些，一般每次上样前样品最好再处理一下
另外，建议检查一下分离胶和压缩胶两种Buffer的pH是不是合格，这个对于指示剂能否跑成很细的线关系很大。

dog002[使用道具]
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发表于 2013-7-16 13:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

敢问楼主,做的是否是基质金属蛋白酶!

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-7-16 13:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

结果及问题:
1.溴芬兰不能完全压成一细线
考虑一下电泳缓冲液的phf值是否正确，我用回收的电泳buf就经常这样
2.溴芬兰各条带不能跑成一水平直线
如果开始就不直可能是孔之间蛋白浓度不相差太大，后来才不直的因为底部又产生气泡
3.采用六一厂的电泳系统, 在制完胶后,两个玻板之间进气泡,不能完全去除
可以不把板卸下，用针头小心挑出胶条
4.制完分离胶后用水封,胶凝后,胶面不是一个直线,而是略向上鼓起
用乙醇封的就好了，而且水封容易稀释胶
5.考染后发现两个边孔的条带出现"微笑"
建议不上样，只用上样bf,或者不作为考查对象
6.各样品之间的条带相互扩散,各跑道不能清楚的分开
7.各跑道宽窄不一,一般是上面窄,越向下越宽,但有时到胶底时又变窄.(是否和玻板与胶之间进了气有关)
某些泳道蛋白含量太高，或者灌胶前没有搅拌均匀导致胶的交联不均一
8.在各个横向条带中有竖向的条带
9.我在考染前从不固定,直接从电泳中选出胶后扔进染色液中,这样好不好?
我只在银染的时候遇到过这种情况，可能是、sds或者dtt含量高，建议染色前用水冲洗几次
10.各浓度之间没有太大差别,是不是我的样品太浓了.另外向我这样从组织匀浆中直接上样电泳行不行,需不需要对样品进行一下处理.
最好不处理下吧，里面的酸糖脂和一些离子应该会有不利影响地
11.我的电泳条带很多,是不是有很多的杂带啊,怎么处理样品才能去杂带?
应该是的，蛋白条带多也是意料之中，怎么说也不会如重组的那么纯，如果这种蛋白定性方便，可以用硫酸安分段盐析，或者走柱子
12.我想问一下我的样品中存在盐浓度太高的问题?怎么才能去盐?
除了以上各位仁兄的推荐，如果蛋白比较大，还可以考虑走G75

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发表于 2013-7-16 13:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

师兄师姐，我在进行活性蛋白质电泳时有些疑问与困难：
1.灌胶时没有气泡，但聚合以后，发现在胶与玻璃板之间有气泡，如何处理呢？
2.分离胶，浓缩胶的聚合时间一般各是多少？可否放在37度烘箱中加速聚合？
3.蛋白质在样品处理时失活，是煮沸失活的，难道真的可以复性？

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1关于气泡的问题,在灌胶前有条件的话可以抽气处理,不抽的话其实问题不会太大.建议你提前从冰箱取出单体和BUFFER,等其和室温差不多再配胶.配胶时如果试剂温度太低凝胶后哪些肉眼不见的气泡可能会明显.
2.室温24度左右,一般7*10厘米的小胶40分钟左右就可以聚合,25*21厘米的2-DE胶一般1-2小时也可以聚合,但建议不要马上使用，最好再放置一会是凝胶充分聚合再使用,温度升高可以加速凝胶聚合,但是过度高温会造成凝胶过快及凝胶不匀,影响凝胶质量.如果你不做凝胶批间平行,一般室温聚合就可以了.
3我没有明白你的意思,呵呵.

pencil菲[使用道具]
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小中大

我说一下我现在遇到的问题：

我用的细胞上清液跑胶，可是还没跑到分离胶时样品就成了上窄下宽的烧瓶状，这是怎么回事啊？另外，当我的样品孔和MARKER孔挨在一起时，样品总是影响MARKER跑出来的条带，即MARKER跑得很歪，我怀疑是上清液的PH值得问题，因为我加完溴芬兰时样品变成了黄颜色，请各位帮忙，谢谢！

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