细胞世界

实验原理：营养缺陷型是指野生型菌株由于突变，致使细胞合成途径出现某些障碍，从而丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源性的补加该营养物质，才能正常生长的一类突变菌株。营养缺陷型菌株广泛用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中，也广泛应用于基因定位、杂交和基因重组等研究的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株的主要步骤有：诱变处理、中间培养、淘汰野生型、营养缺陷型菌株的检出和鉴定。
（一）菌液的制备
1.取新活化的枯草杆菌7658斜面菌种（使用前先活化16-18小时）一环，接种于20 mL完全培养基中，于37℃培养16-24小时，取1 mL转接于20 mL新鲜完全培养基中，37℃振荡培养6-7小时，使细胞处于对数生长期。
2.取10 mL培养液，离心（3500r/min）收集菌体，用生理盐水洗涤2次，然后将菌体充分悬浮于生理盐水中，在分光光度计上测定菌液浓度，调整菌液中细胞浓度为108个/mL左右。
（二）.诱变处理
取10 mL细胞悬浮液于无菌培养皿中（带搅拌棒），以紫外线照射60 s。
（三）.中间培养
取1 mL处理菌液转接于 20 mL完全培养基中，37℃避光振荡培养过夜。
（四）.淘汰野生型（青霉素法）
1.取10 mL中间培养液，离心（3500r/min）收集菌体，用生理盐水洗涤2次，然后转入10 mL无氮基本培养基中，37℃振荡培养6-7小时（饥饿培养）。
2.将全部菌液转入10 mL 2倍氮源基本培养基中，37℃振荡培养1-2小时,加入终浓度为100 u/mL青霉素（母液浓度为2000 u/mL）继续培养5-6小时,使青霉素杀死杀死野生型细胞，达到浓缩缺陷型细胞的目的。
3.取10 mL菌液，－离心收集菌体，将菌液用生理盐水洗涤1次，最后将菌体充分悬浮于10 mL生理盐水之中。
（五）营养缺陷型菌株的检出
1.取0.1 mL菌悬液，涂布于限制培养基平板上（重复3皿以上），37℃培养48小时,培养，野生型形成大菌落，缺陷型形成小菌落。
2.制备用完全培养基和限制培养基平板各4个，并在皿的后面划方格（每皿30格）。
3.用无菌牙签从限制培养基平板上逐个挑取小菌落，对应点接在基本培养基平板和完全培养基平板上（先点接MM平板，再点接CM平板，位置一定要对应），37℃培养48小时,将在CM上生长（完全培养基生长）而在基本培养基（MM）不长的菌落挑入完全培养基斜面，37℃培养24小时,作为营养缺陷型鉴定用菌株。
（六）营养缺陷型菌株的鉴定
取待测斜面菌种1环接种于5 mL生理盐水中，充分混匀，离心收集菌体，将菌体充分悬浮于5 mL生理盐水中。
取1 mL待测菌悬液于培养皿中，倾入15 mL约融化并冷却至45-50℃的基本培养基，摇匀，待凝固，为待测平板。
将待测平板底背划分为三个区，在培养基表面的三个区域上分别贴上蘸有氨基酸混合液、维生素混合液、核酸水解液的滤纸片，37℃培养24小时，观察滤纸片周围菌落生长的情况。初步判断要求的营养物质范围。

分组的氨基酸混合液
组别


氨基
酸




1
组氨酸
苏氨酸
谷氨酸
天冬氨酸
亮氨酸
甘氨酸

2
赖氨酸
苏氨酸
蛋氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
丙氨酸

3
苯丙氨酸
谷氨酸
蛋氨酸
酪氨酸
色氨酸
丝氨酸

4
胱氨酸
天冬氨酸
异亮氨酸
酪氨酸
精氨酸
脯氨酸

5
亮氨酸
缬氨酸
色氨酸
精氨酸



6
甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
脯氨酸



（七）生长谱法鉴定营养缺陷型的营养要求
根据初步鉴定的结果，对单一缺陷的菌株进行鉴定。
只在核酸水解液上生长的菌株：将两块待测平板各分成6个区域，每一区
域上放置一种碱基、核苷或核苷酸。
维生素缺陷菌株：将待测平板各分成6个区域，每一区域上放置一种维生素。
氨
基
酸缺陷菌株：将各种氨基酸按上表分成6组，配成混合液，在待测平板的每一区域上放置一种混合氨基酸溶液的滤纸片。于37℃培养24小时后，观察生长圈，并确定其为哪种营养缺陷型。
营养缺陷型菌株对营养要求的位置
生长圈位置
营养要求
生长圈位置
营养要求

1
组氨酸
2,3
蛋氨酸

2
赖氨酸
2,4
异亮氨酸

3
苯丙氨酸
2,5
缬氨酸

4
胱氨酸
2,6
丙氨酸

1,2
苏氨酸
3,4
酪氨酸

1,3
谷氨酸
3,5
色氨酸

1,4
天冬氨酸
3,6

丝氨酸

1,5
亮氨酸
4,5
精氨酸

1,6
甘氨酸
4,6
脯氨酸

注：
1.细菌完全培养基（完全培养基，CM）：葡萄糖5 g，牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨10 g，MgSO4·7H2O 2 g，不加或加琼脂20 g，水1000 mL，pH7.2, 1×105 pa 20 min。
2.细菌基本培养基（MM）：葡萄糖5 g，（NH4）2SO4 2g，柠檬酸钠 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO4 6g，K2HPO4 4g，不加或加处理琼脂2.0%，dH2O 1000 mL，pH7.0-7.2，121℃，20 min.。
3.无氮基本培养基：在基本培养基中不加入（NH4）2SO4和琼脂。
4.2倍氮源基本培养基：在基本培养基中加入两倍（NH4）2SO4，不加琼脂。
5.限制培养基：向配制好的液体培养基中加入0.1-0.5%完全培养基，加入2%琼脂。
6.补充培养基：向配制好的基本培养基中加入特定的氨基酸、碱基、维生素或核酸水解液、
7.苯丙氨酸限制培养基：向配制好的基本培养基中加入5 mg/L苯丙氨基酸。
8．苯丙氨酸补充培养基：向配制好的基本培养基中加入10 mg/L苯丙氨基酸。
9．肉汤葡萄糖培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g ，葡萄糖20 g，不加或加琼脂15-20 g，水1000 mL，pH7.0-7.2, 1×104 pa (112℃)30 min。可代替完全培养基

好像很复杂的样子，代谢太麻烦了！