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标题:【求助】有关稀有密码子,请高手指导!

静夜思[使用道具]
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1
 

【求助】有关稀有密码子,请高手指导!

目前正在做一种丝状真菌蛋白的异源表达,打算在毕赤酵母和大肠杆菌中同时做,在分析目标基因的时候发现,基因中存在一些稀有密码子,版子里面对稀有密码子也有一些讨论,但还是有一些问题需要请教:
1)稀有密码子的存在,对蛋白的表达是否有致命的影响?
2)我的稀有密码子位于序列的中间,对目标蛋白表达的影响如何?
请战友们多多指教!
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utt0989[使用道具]
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2
 

对于密码子的位置一般没有什么关系,
主要 是由于稀有密码子的存在可能会表达出truncated protein,致使蛋白的性质发生变化或者丧失。
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NBA[使用道具]
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我表达过的重组蛋白中有好几种存在主任遇到的情况,结果也各不相同。印象很深的是,在表达Sak时,基因中段也是有连续几个原核稀有密码子(AGA,AGG),定点突变麻烦,但在大肠杆菌中的表达量也高达50%以上。再,个人认为,稀有密码子的位置还是有影响的,位于5’端影响更大。我在做另一个基因的功能分析时,曾分别定点突变了5’、3’和中间的几个氨基酸,同时也顺便改造了这三个区段内的几个稀有密码,发现5’修改后表达量有显著改善。当时设想表达翻译的时侯,是否存在一些近似于物理中的“惯性”?呵呵。
理论和实际是有差距的,我说得现象也不能说是共性的东西。做了一些表达,个人的感觉基因是很有“个性”的。当然,也许我们做得还不够多,未能充分领略其中的奥妙。不管怎么样,我建议主任不妨先试试,克隆表达的操作程序现在毕竟已经是不算复杂了。
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静夜思[使用道具]
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对于蛋白表达是新手,很多东西都不太懂,前段时间做了一个基因的表达,但没有得到表达产物,考虑了多种因素以后觉得可能是 稀有密码子的影响,这次我对基因的5’端的密码进行了优化,希望能有好结果!

另外,还有两个问题想请教战友:
1)我在看文献的时候,有些文章认为用PIC9K作为表达载体(毕赤酵母)的时候应该把基因的信号肽(真核基因)去掉,因为载体上已经有信号肽序列;而有些文章却认为信号肽的存在有助于蛋白的正确折叠,有些困惑!
2)真核基因在原核系统中的表达情况如何?
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NBA[使用道具]
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> 对于蛋白表达是新手,很多东西都不太懂,前段时间做了一个基因的表达,但没有得到表达产物,考虑了多种因素以后觉得可能是 稀有密码子的影响,这次我对基因的5’端的密码进行了优化,希望能有好结果!>
----基因不表达,在确认基因和载体以及表达条件都没有问题的情况下,除了考虑密码子之外,建议你用软件分析一下载体启动子到插入基因的前30~50个硷基这个区段的mRNA构象,看看是否会形成发夹结构。

> 另外,还有两个问题想请教XD_laurel战友:
> 1)我在看文献的时候,有些文章认为用PIC9K作为表达载体(毕赤酵母)的时候应该把基因的信号肽(真核基因)去掉,因为载体上已经有信号肽序列;而有些文章却认为信号肽的存在有助于蛋白的正确折叠,有些困惑!
----还是那句话,此基因和彼基因也许都不一样。因为蛋白的折叠受环境因素和自身因素的影响,而信号肽也只是自身因素中的一部分。还有文章认为,用基因本身的信号肽代替载体上的酵母阿尔法交配因子信号肽分泌效果更好,因为交配因子信号肽太长,表达时太浪费物质和能量资源。我还是认为做表达试验,预先不必要把问题想得太多,做了看看结果再说;当然,条件时间许可,也不妨几种试验方案同时实施,比较一下结果的差异,也挺好。

> 2)真核基因在原核系统中的表达情况如何?
>----呵呵,你这个问题太大,我不认为我具备回答的资格和水平,但还是硬着头皮想说两句。原核系统表达真核基因,需要考虑的问题有两个层次:1)能否表达;2)能否获得有活性的表达产物。应该说,通过基因全合成技术,第一个层次的问题理论上应该不能称之为问题,但大基因的全合成,对于国内很多实验室还是个现实问题。第二个层次的问题就复杂些,最好的情况是表达的蛋白就是以可溶性的活性形式存在,可惜目前这样的好事并不多,尽管多种新的技术(如双载体共表达)和宿主菌株(如转入了可组成型表达某些所谓的chaperone)已经有了成功的应用范例。包含体的体外复性,则又是一个令人头疼的问题,没有人敢说在这方面是“手到病除”的专家。

以上如有不妥之词,主任请指正。
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bring[使用道具]
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NBA斑竹,您对蛋白表达非常内行,请帮小弟解决难题:我的基因氨基端前70个氨基酸中就有6个稀有密码子,第一个是出现在21位氨基酸,这样的频率算高吗?我表达了一个月,没有任何结果,是不是稀有密码子的问题?多谢!!!
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youyou99[使用道具]
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我的目的片段开放阅读框编码82个氨基酸,准备在BL21中表达,基因是在高等生物中调出来的,在网上看到有密码子偏好问题,查了一下子,在大肠杆菌中的稀有密码子,我的片段中有两个,CGG出现了一次,CCC出现了5次!不知道对表达有没有影响啊?!!请各位大侠帮帮忙!!谢谢了!
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orangecake[使用道具]
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我做的这个蛋白,已经有人在别的pMAL-2X上表达了,但是我构建到PET-43a载体上就是表达不出来,难道是阅读框变化了?还是移码突变?应该不是稀有密码子的问题吧
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