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标题:【分享帖】western新手学习

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发表于 2013-7-20 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享帖】western新手学习

一楼给自己

我是western新手，刚学会western没多久，现在经常会用到western，也经常会犯一些错误

我想把一些新手遇到的问题和我找到的解决放贴在这里，希望能让自己记得更牢，也算是一种对新手的鼓励吧
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发表于 2013-7-20 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今日跑western，从点样到跑胶都很顺利，但转膜犯了大错

我是湿转，平常的顺序从下往上依次是：黑色夹子-海绵-三层滤纸-聚丙烯酰胺胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-白色夹子。

但是今天我把顺序颠倒了下，从下往上变成了：白色夹子-海绵-三层滤纸-聚丙烯酰胺胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-黑色夹子。结果转膜结束后发现，膜上空白一片，连marker都没有看见，丽春红染色膜也是空白的。

后来找到原因了，电流是从正极(黑色夹子)向负极(白色夹子)流动的，蛋白在变性后吸附了SDS带负电，所以也是从负极向正极迁移，所以，不管怎么安排，PVDF膜都应该放在胶的正极那一侧，这样子，蛋白才能顺着电流转移到PVDF膜上。如果反了，那就像今天的我一样，悲催了囧，蛋白统统跑到另外一侧的滤纸里去了，啥也截留不下来。

很低级的问题，写在这里，下次肯定不犯了。
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发表于 2013-7-20 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天做western，又失败了。原因是因为把running buffer当成了Transfer Buffer倒入了转膜槽，后来发现后虽然换了转膜液作为补救，但是已经迟了，最后转膜出来的效果很差。准备明天再跑！

今日提取小鼠褐色脂肪组织蛋白，因为有很多脂肪的关系，所以离心了2次，每次4° 12000rpm，最后尽量取澄清的部分。另外最后测浓度时，按照1:50稀释，没有问题。因为蛋白浓度较高，所以最后加入了2×的loading buffer变性。
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发表于 2013-7-20 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天一口气跑了4块胶，操作耗时也比较长。

今天在电泳时，总感觉有一块胶条带压得不够细，有点弥散。后来发现是running buffer没有加满电泳槽，加满之后，条带果然漂亮多了~

前一次跑western，发现有一个蛋白的条带特别脏，不知道哪个是目的条带，于是今天采取措施：

1)延长封闭时间，尽可能消灭非特异位点

2)延长漂洗时间，尽量减少一抗和二抗的非特异结合

3)减弱显影液强度，用 ddH2O 1：1 稀释混匀后再显影
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发表于 2013-7-20 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
晚上忙着做其他实验，就把跑好的胶多放了会，10点半开始转膜，12点左右封闭，用的是10%的脱脂奶溶于TBST，然后我就放在4°冰箱中封闭过夜了，但是有个问题，平常我们都放在摇床上室温封闭1小时的，今天放在冰箱中封闭，就没办法震摇了，这样对封闭会不会有影响呢？
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发表于 2013-7-20 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看我的师姐是在室温下摇床2小时封闭的。不知道你这样可行？等待你的结果...
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发表于 2013-7-20 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
晚上忙着做其他实验，就把跑好的胶多放了会，10点半开始转膜，12点左右封闭，用的是10%的脱脂奶溶于TBST，然后我就放在4°冰箱中封闭过夜了，但是有个问题，平常我们都放在摇床上室温封闭1小时的，今天放在冰箱中封闭，就没办法震摇了，这样对封闭会不会有影响呢？

===================================================================

我们常这样做，4℃过夜的效果比37℃好，不摇没有关系，但奶粉要溶解完全，不要有颗粒。
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发表于 2013-7-20 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
晚上忙着做其他实验，就把跑好的胶多放了会，10点半开始转膜，12点左右封闭，用的是10%的脱脂奶溶于TBST，然后我就放在4°冰箱中封闭过夜了，但是有个问题，平常我们都放在摇床上室温封闭1小时的，今天放在冰箱中封闭，就没办法震摇了，这样对封闭会不会有影响呢？

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没有多大影响
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发表于 2013-7-20 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢上面几位高手的回答，哈哈~

我的结果也出来了，条带的背景还行，感觉影响不大

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又压了western的条带，但是感觉β-actin不平，我之前在提取蛋白时，根据BCA Protein quatification的结果，用蛋白裂解液和loading buffer将蛋白浓度调整到一致了，可为啥我的western条带的β-actin还是不平呢？？不得其解，打算再跑几次试试看
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-7-20 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这几天要上课，没去实验室学习。

弱弱的问一下LZ，所谓的压条带，是不是指所加的样品跑胶时很齐在一条线上？这是不是跑胶蛋白上样时操作以及胶配的好坏有关啊
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