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标题:【求助】WB曝光背景太深

jingling845[使用道具]
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发表于 2013-7-24 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB曝光背景太深


各位高手，我刚开始做WB，我的分子量是97KD，120V恒压转膜转2个小时45分钟，转完膜后立春红染色有条带，用5%脱脂奶粉（TBST稀释）室温封闭两小时，用碧云天的一抗稀释液稀释一抗孵育过夜，1:5000稀释二抗，洗膜用TBST洗两次每次15分钟，用TBS洗一次15分钟，曝光，加上ECL2分钟后整张膜发亮，未见条带放光，爆出来后内参和目的蛋白都有条带，但是背景很深，是怎么回事呢？？谢谢~~
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tie8[使用道具]
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发表于 2013-7-24 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提高一抗二抗的稀释比例
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紫烟[使用道具]
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发表于 2013-7-24 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你一次做几张膜，洗膜的时候要分开洗膜，一抗孵育过后背景杂带较难洗掉，要洗充分，以上只是原因之一，仅供参考小女的意见。
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jingling845[使用道具]
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发表于 2013-7-24 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了两张膜，一张内参，一张目的蛋白。您说的洗膜洗充分是什么意思？？您是怎么洗的？？什么洗？？几遍？？每遍几分钟呢？？谢谢~~
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-7-24 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议延长封闭时间，4度过夜也可以，楼主试试再交流
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qqq111[使用道具]
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发表于 2013-7-24 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

简单，把二抗稀释一倍，一抗也适当稀释点就可以了。
封闭2h一般都足够了。
最好来张图。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2013-7-24 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有，一二抗洗涤各加洗一次（4次）。
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jingling845[使用道具]
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发表于 2013-7-24 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天又跑胶了，按高手们给的意见做了 我是这样改善的内参一抗稀释没变，二抗上次为（1:2500），这次变为1:5000，封闭五小时，洗膜四次，每次15分钟，内参曝出来了很漂亮。目的蛋白我也改善了，同时跑了两块，剪成不同的小块加不同的一抗二抗浓度，有的把一抗稀释倍数提高一倍，有的把二抗稀释倍数提高一倍，有的同时提高，几张膜都是封闭5小时，两次抗体后的洗膜都是四次，每次15分钟，结果只有一抗没变并二抗稀释倍数提高一倍的那一张爆出来了，还是背景很深，怎么办呢？？我一抗说明书上建议的稀释倍数是（1:200~1:1000），我做了1:200的有条带但背景很深，1:500没有背景也没有条带。
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-7-24 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是你封闭的问题，封闭时的环境温度不要太低，冬天的话要开空调；还有封闭时要在摇床上慢摇。
还有可能是你的二抗浓度有点高。
或者在曝光的时候压片时间久一些，背景会降低一些。
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jingling845[使用道具]
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 小中大

谢谢哦，我是在福建，现在室温有20度呢，挺热的。压片时间久是不是就是曝时间久一些，曝得越久不会背景越深吗？
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