小中大 在用大肠杆菌系统表达外源蛋白时，蛋白表达量的高低往往起着最为关键的作用，而影响表达量的因素是多方面的，就宿主和载体本而言，存在着调控元件的影响，如启动、SD和RBS序列；载体在宿主中的复制能力；以及外源蛋白在宿主的稳定性等。用融合蛋白表达外源蛋白的优点就在于它能减少上述因素的不利影响，提高蛋白的稳定性，而事先装配于载体上的表达产物往往成为蛋白纯化的标记，由此方便了特异蛋白质的表达与提纯。
澳大利亚Simth和Johnson构建了PGEX质粒，他们在载体上接上了寄生蠕虫schistosoma japonicun的sJ26蛋白基因，表达了一种26kDa的谷胱苷肽S-转移酶，所表达出来的融合蛋白质大部分是可溶的，可以在不变性的条件下用谷胱苷肽亲和柱进行层析，从细菌裂接物中提纯，GST载体可以用识别特异性位点的酶，如凝血酶和凝血酶因子Xa从融合蛋白中去除,然后GST载体及末端切割的融合蛋白可以用谷胱苷肽-Agarose吸附除去。
pGEX系列的载体保留了E.colipBR322的复制启始区，使用了tac启动子，紧随其后的是sj26的完整序列，但终止密码子被polylinker取代，后面带终止密码子TGA，-内酰胺酶基因使之表现出氨苄青霉素抗性，大肠杆菌乳糖操纵子（即lacZ操纵子）的片段，包括lac阻遏物基因lacIq，以及部分lacZ。
pGEX系列的载体在任何宿lac阻遏物的调控，转录可以被 IPTG所诱导，对pGEX的表达系统经过一定量的IPTG诱导以后，可以合成一个27.5kDa的蛋白，它的C端带有10个附加的氨基酸序列，而且这10个氨基酸残基不会影响GST同谷胱苷肽的结合。
SD及RBS序列对基因的转录和翻译效率有很大的影响，尽管许多载体启动子后的多克隆位点为不同的基因找到合适的接口提供了方便，但不同的切口导致启动子与翻译起始密码子之间碱基的种类和数目不同，使表达效率有很大的差异，而pGEX系列质粒的多克隆位点在GST基因之后，无论外源基因以何种接口接入，都不会改变这个载体的SD及RBS序列，只需选择正确的开放阅读框，就可以表达出GST融合蛋白。
由于tac启动子是可诱导的强启动子，受lac阻遏物调控，由于载体本身带有lacIq基因，所以即使在大肠杆菌lacI中（即本身无法合成lac阻遏物的菌株），它的转录需经IPTG的诱导的性质也不会改变。在表达外源蛋白的过程中，可以根据所需表达的外源蛋白的性质选择适当的时机进行诱导，便可以得到较高的产率。
在纯化蛋白质时，条件比较温和，许多用基因工程菌株生产的外源蛋白即使维持了一级结构，也不能表现出生物活性或活性很低，一个非常重要的原因就是在纯化蛋白时加入了变性剂从而改变了蛋白质的空间构象。而GST融合蛋白，可以直接从细菌裂解液中用固定化的谷胱苷肽将其吸附，洗脱条件温和，整个过程没有变性剂的加入，最大限度的保持了蛋白的天然构象。
此外，由于在GST与目的蛋白质间设计了凝血酶（或Xa因子）的识别切割位点，所以纯化后的GST融合蛋白只需要加入凝血酶就可以将GST切下，而GST和未被凝血酶作用的融合蛋白仍然可用谷胱苷肽吸附去除，这样可以得到纯度很高的目的蛋白。
我诱导时采用低温,低温诱导可能会降低蛋白产量,但能明显降低蛋白酶活性（我没有使用蛋白酶抑制剂）,可以产生更多的未被破坏的蛋白,且可溶性蛋白的比例提高.琼脂糖只能与溶解的蛋白结合.在诱导，纯化中尽量保护低温，否则目的蛋白有可能从GST融合蛋白上掉下来．我第一次得到的纯化产物检测发现只有GST蛋白，而且检测发现不是我把GST蛋白当GST融合蛋白诱导弄错了。后来所有操作都在低温下进行，得到了融合蛋白。
增加可溶性蛋白，可通过改变生长条件来实现，如降低生长温度，降低IPDG浓度，改变诱导时间，增加空气等等．具体条件只能依经验而定．加溶菌酶，Ｓarkosyl等都可增蛋白的溶解性，Sarkosyl浓度对每一个蛋白可能并不一样． 溶菌酶处理后加DTT，再加Sarkosyl能明显增加GST融合蛋白与琼脂糖珠的结合能力．加TritonX-100 后，也能增加融合蛋白与琼脂糖珠的结合能力．TritonX-100还能防止Sarkosyl与钙镁结合形成沉淀．两者比率要依经验而定．但你第一次做时，不要考虑太多，先严格按分子克隆或法玛西亚的方法做一遍，看看结果再说，
有些措施可以提高融合蛋白的洗脱率．如增加洗脱时间，增加洗脱液体积，增加还原性谷肽甘肽的浓度，增加洗脱buffer的ph值，等等．
培养基中加葡萄糖是为降低基本表达，诱导时不要用冻存加甘油的菌，否则很可能不能正确表达．
还有上纯化柱子之前，你的溶液要非常干净，否则会把柱子给堵上的，我第一次做时就把柱子给堵了。
法玛西亚的说明书很好，应该好好看看
