【求助】惨不忍睹的co-ip

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标题:【求助】惨不忍睹的co-ip

daod[使用道具]
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发表于 2013-7-26 17:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

co-ip来来回回p了几个月了，结果非常不稳定，坏的多余好，逮着人就问还是找不出要领，求解呀求解
图补上
ip的整个就全黑的，input 还ok
p数十次，偶尔人品爆发也能p出好看的条带，想不出操作哪里不一样，
用的是sigma的flag的珠子，课题中涉及co-ip很多，平均一个ip实验用一支珠子，耗费的除了钱以外还有我宝贵的时间和心血。
最近p内源性的，A,B蛋白的抗体，以及珠子都是santa的，更是一次有点靠谱的图都没有，全是一道道的全黑的，有显影液的地方都是黑的，抗体不是很好，但wb也能用，都是多抗。珠子抗体用量参照santa说明书来的，蛋白量一般500-1000ug 图为内源性的

附件

2013-7-26 17:59

46490939.jpg (6.23 KB)

yychen[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 daod 于 2013-7-26 17:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

co-ip来来回回p了几个月了，结果非常不稳定，坏的多余好，逮着人就问还是找不出要领，求解呀求解
图补上
ip的整个就全黑的，input 还ok
p数十次，偶尔人品爆发也能p出好看的条带，想不出操作哪里不一样，
用的是sigma的flag的珠子，课 ...

不好意思，非得上图；至于你说不会上图，你不会连email添加附件都不会吧，这不是同理嘛？把"需要消费丁当才能下载本附件"的选项勾掉，不要给别人找麻烦，你会获得更多帮助

yychen[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还是不对，既然你提到input还OK，那为啥不一起秀，还可以顺便分析抗体的情况；这样的条带，我只有最近用一款scbt的兔抗ubiquitin才见到，重要的是IgG也是一片，只能认定抗体质量问题；用scbt的另一款鼠抗就没有问题了。所以，我需要看你的input。另外，我有问你是不是aHis，或者刚提的兔抗ubiquitin？

daod[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

input之前跑的，不是同一次跑的所以没有show
内源性co-ip检测A,和B的相互作用，
上面的图左边是igG,右边是IP A,IB B
A是核受体，B是一个磷酸酶，都是很普通的蛋白质，
input如图;位置对应是最下面那条band，上面杂带比较多

用于input对应的是第一个样品，input是75ng，第一张图ip用的是蛋白是1000ng

附件

2013-7-26 18:02

53977427.jpg (7.25 KB)

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发表于 2013-7-26 18:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 daod 于 2013-7-26 18:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

input之前跑的，不是同一次跑的所以没有show
内源性co-ip检测A,和B的相互作用，
上面的图左边是igG,右边是IP A,IB B
A是核受体，B是一个磷酸酶，都是很普通的蛋白质，
input如图;位置对应是最下面那条band，上面杂带比较多

用 ...

所以你的问题多多，首先input应该show A、B蛋白各自的内源水平，而且要跟IP一起跑、一起操作，才能分析是否是抗体的问题。你现在给出的图例，我很难分析原因。我在IP指南的回复中show过一个处理过的模糊的图例，很清楚左边NE（也就是input），右边coIP，实际上原来的膜上面分开这两部分的是中间的蛋白marker，同一张膜同时孵育抗体。
PS：当然，实际上我之前得回复就在暗示你--你的抗体有问题，如果你说IB B蛋白，那么很可能问题出在B蛋白抗体上

tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主的问题是你CO-IP 后的样品煮过了，沸水煮别超过5分钟，煮好的样品分装不要反复冻融。个人非常宝贵的经验，试试吧，包你灵验！呵呵，做好了给我留言！

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问个弱弱的问题，您是如何判定这个方法的假阳性的呢？？

yychen[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问个弱弱的问题，您是如何判定这个方法的假阳性的呢？？

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回复过，用同样种属的不相干的任意抗体做阴性对照。

yychen[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主的问题是你CO-IP 后的样品煮过了，沸水煮别超过5分钟，煮好的样品分装不要反复冻融。个人非常宝贵的经验，试试吧，包你灵验！呵呵，做好了给我留言！

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呵呵，不要拿次要问题来掩盖本质。煮沸超过5分钟也不是一次两次出这类的问题了——有点健忘；反复冻融、没分装也不是没干过；有的时候样品里面残留尿素，室温不能融化，样品不仅反复冻融，每次还要煮沸溶解，样品过多没来及上样就又可能凝固了，就要再煮；这样同样的样品用个好几次的话，前前后后怎么也会煮超过45分钟。你所提供的建议，鄙人每条都破坏过，实验结果未出现根本性的改变。

daod[使用道具]
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发表于 2013-7-26 18:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一，我所在的实验室默认蛋白变性事99度10min，如果有影响，请指教。
第二，input和ip没有一起跑妨碍抗体分析确实是我的不对，以前也有一起跑的，也出现过，有些很丑的结果没有保存
第三，ip样品全部一次上样跑了，不存在反复冻融。
第四，谢谢各位的回复，前阵子有点事情没能上网，尤其感谢jacqueslm2001大哥，新的抗体已经买了，用于排除抗体问题，到时候结果拿出来和大家一起分析，
祝好！

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