小中大您好,
首先,您太客气了,我是新手,不是老师。看得出您很专业,我用的确实是PET32。但是,如果在trombin酶切位点切开,应该有15KD和8KD两条带,从大小看显然不是中间那两条。另外,Trx标签我认为是那条粗带,但是我找不到目的蛋白,因为目的蛋白大小是5.5KD,下面那条似乎不太可能是。
我用另外一种肠激酶又切了一次,有结果马上发上来。
再次感谢您的指导。
===========================================================================================================
您好!
我个人的建议:
1.western鉴定下,哪个是标签,应该是我说的那条带;
2.加大酶量,确保酶切完全彻底,[跑胶的时候加大上样量,因为小肽跑PAGE胶,容易弥散,需要ug以上的量才能看见;
3.个人觉得有时跑胶,marker只是做为参照,实际上您的目的蛋白的分子量不一定就出现在您和marker相应的位置,有时会有点偏差,如果您不好判断的话,可大量酶切一次(现在EK都很便宜的啊),然后过镍柱,收集流出液,跑电泳看看是哪条带,理论上流出的蛋白应该是您融合蛋白酶切后的目的蛋白.
祝好运!