【求助】构建好的质粒怎么4度保存了几天就表达不出蛋白了

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标题:【求助】构建好的质粒怎么4度保存了几天就表达不出蛋白了

04906[使用道具]
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发表于 2013-7-29 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本来构建在pvb220上的，新转化的质粒，能很好的表达。涂好板并且保存了甘油菌
一个星期后，平板上挑的表达差了很多，取保存菌摇过夜再表达也几乎没有
不知道什么原因。问了同事，他们说可能是温度诱导条件不好控制。
后来把基因从pbv220上切下转到ptha质粒上，酶切鉴定已经正确克隆到ptha上了。用IPTG表达设空ptha对照。对照表达了融合蛋白但是目的基因没有表达也无融合蛋白产生。
该蛋白大小为55kD
请指点，谢谢！·！

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-7-29 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

try it again from the start point.

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-29 16:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是诱导过程的事。如果保存菌的过程没有问题的话。

wsll[使用道具]
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发表于 2013-7-29 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

ICE这么晚了还来逛？真的辛苦。也许你在国外吧，正是白天。不过你很热心，题外话。呵呵。

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-29 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也遇到类似情况，是用pET-30构建的表达质粒在BL21（DE3）中表达，会出现你所说的那种情况。而且即使重新用重组质粒转化BL21（DE3），也不是所有阳性转化子都能得到好的表达，挑出来的转化子传2代表达量就很低了，不知道什么原因。但是，如果是融合了HIS6的表达质粒在BL21（DE3）中就能稳定表达。

nut6694[使用道具]
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发表于 2013-7-29 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前段时间一直在心烦发表文章的事情，现在最重要的文章基本上落实了，应该能按时毕业，可以安心过年了。现在在做表达产物的纯化和补充一些试验。

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发表于 2013-7-29 16:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

此类的问题我曾遇到过.
解释:质粒的不稳定性,有些构建的表达质粒在宿主菌中传代很不稳定,随代次增加而丢失,可能是宿主菌对有害表达质粒的一种保护性机制(探讨).

cj_mondy[使用道具]
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