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标题:【求助】关于考马斯亮蓝染色问题

niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-7-30 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于考马斯亮蓝染色问题

我刚刚入手蛋白质表达实验阶段，做了几次SDS-PAGE
发现染色效果不好，染色模糊，而且越是低分子量的蛋白质越是着色模糊，蛋白条带也很少。
我的染色液配制时间不长，我配制的成分是 ：水 异丙醇 冰乙酸 考马斯亮蓝
脱色液是 ：水，冰乙酸 乙醇
我问老师染色液中异丙醇与脱色液中乙醇不一致，是否影响染色效果，老师说不影响。
所以我现在想请教为什么我的染色效果不好？
还有一个问题就是电泳完毕直接染色，还是先浸泡在固定液一会再染色
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yychen[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是与染色液和脱色液的配制有关呢？

一般用的染色液: 蒸馏水 甲醇 冰乙酸 考马斯亮蓝R-250；脱色液：蒸馏水，冰乙酸 甲醇

电泳完毕后直接用蒸馏水漂洗凝胶两次即可进行染色。
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standbyme[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电泳完毕后直接用染色液染色即可！另外，染色液和脱色液可以相同，只是染色液中有染色剂。低分子量的蛋白质越是着色模糊可能是蛋白质从胶的空隙中逃了，适当加大胶的交联度，快速染色（微波加热）可能回奏效。如果是低分子量的蛋白比较多，用尿素胶体系一试！
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个问题就是电泳完毕直接染色，还是先浸泡在固定液一会再染色
？
我用的染色方法有两种：
第一种是电泳完毕后，直接染色，但染色的时间长一般需要过夜染色，然后先用高浓度脱色液脱色，再用低浓度脱色液脱色；
这用方法的缺点是时间太长了。
第二种方法是电泳完毕后，先固定30分钟，然后高温进行染色30分钟，在高温进行脱色，一般很快就会出现结果，但这种方法的蛋白胶不太容易制成干胶。
两种方法染色效果都挺好的！！！
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jkobn[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问什高浓度脱色液和低浓度脱色液区别是什么
我觉得是不是我电泳的电压太高，产热高，导致染色效果也不好
我电泳的电压是350~420V，电流是30mA~40mA,我开始认为是我的缓冲液配置有误，重新配制仍然是这样，而且因为是双面跑胶，总是一面跑的快，一面跑的慢，是因为两面的浓缩胶和分离胶不一样长，还是电泳槽的问题呢？电压太大会不会影响我的染色效果呢？
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵，高浓度稀释不就成了低浓度吗？低浓度为了偷懒脱色过夜用的。
象我这种懒人。我是一跑完胶就用自来水洗一下，然后考染5分钟，然后就是脱色拉。
跑分离胶电压为100v，浓缩胶为200。
你所说的“发现染色效果不好，染色模糊，而且越是低分子量的蛋白质越是着色模糊，蛋白条带也很少”
我估计是电泳缓冲液的问题。你用一下新的看看
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00无名指00[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得有可能是染色的时间短，一般要0.5-1小时的，染色时间短，自然带少，至于模糊要注意胶浓度问题，小分之的热扩散厉害，所以不要电泳时间太长，胶浓度别太低，电泳的电流稍微小点，小分子模糊是很正常，只要不很厉害没有关系。
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我每次都是染色过夜的，应该染的透彻，因为总是一板胶跑的快，一半胶跑的慢，跑的快的染色效果 较好一些，跑的慢的小分子量的蛋白就什么也看不到。
我配制的是15%浓度，我觉得不是胶浓度的问题，应该是电泳的问题。
因为电流小，当然跑电泳时间长，电流30mA，电压都380V了。
我觉得好象也不是电泳液配制的问题，因为电泳液我配制了好几次，都是这样，而且如果是电泳液的问题，应该不会影响两板胶跑的速度问题。
这样排除各种因素，是不是电泳装置的问题呢？
各位大虾不知同不同意我的分析。
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kulee[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问什高浓度脱色液和低浓度脱色液区别是什么
我觉得是不是我电泳的电压太高，产热高，导致染色效果也不好
我电泳的电压是350~420V，电流是30mA~40mA,我开始认为是我的缓冲液配置有误，重新配制仍然是这样，而且因为是双面跑胶，总是一面跑的快，一面跑的慢，是因为两面的浓缩胶和分离胶不一样长，还是电泳槽的问题呢？电压太大会不会影响我的染色效果呢？

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困惑中,您跑的是mini胶还是大胶,mini胶的电压能跑到这么高吗?发热量太大的话肯定蛋白质容易扩散.您用的电泳条件是恒压还是恒流亦或恒功率?难道您两面的浓缩胶和分离胶不一样长吗?如果不一样长那么肯定两面跑的速度不一样,分离胶和浓缩胶PH值和胶浓度都不一样,跑的快慢当然也不一样啦.
感觉问题还真不一定是染色的问题
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2013-7-30 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是的，我跑的胶是mini胶，电泳的条件是恒流，我两面的浓缩胶和分离胶确实是不一样长，您说的对，如果胶不一样长，会影响电泳的速度，我再调一下实验条件，使胶的长度大致一致，如果还是跑的不一样，那也许就是电泳装置本身的问题了。谢谢楼上大虾的回复！
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