蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【分享帖】一种简单的亲和纯化方法

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 21  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【分享帖】一种简单的亲和纯化方法

箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
1

发表于 2013-7-31 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享帖】一种简单的亲和纯化方法


在普通的分离中一般都用层析柱分离，但是需要柱子和设备，这就限制了亲和介质的应用，这里介绍一种方法可以不需要层析设备就可以做分离纯化：
依据重组蛋白的表达量算出要用的金属螯合琼脂糖凝胶的量，金属螯合琼脂糖凝胶的载量为10mg/ml左右，样品先过滤，然后把一定量的介质直接投到样品中，在摇床上震荡5-12小时，保证要让介质悬浮起来，这样吸附更充分，而后抽滤，再用5倍介质体积的缓冲液含0.5M的NaCl在抽滤器上分三清洗，随后用3倍缓冲液含50mM咪唑分两次清洗，最后用3倍缓冲液含50mM咪唑分两次清洗，把收集的清洗部分跑电泳鉴定，这样不需要柱子也就可以分离带his标签的重组蛋白，快捷而且方便，没有柱子的情况下不妨一试，这个方法也适用于别的层析介质，只是洗脱方法不同而已。
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
2

发表于 2013-7-31 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是版主 自己用过的吗？看起来很不错。以前做过免疫亲和层析就是先用抗体与胶粒放一起摇一阵，摇后装柱。想来应该是一个道理。
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
3

发表于 2013-7-31 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是呀，我最近很喜欢这样的方法，包括去内毒素我都是这么做的，我觉得非常好，而且对于某些作用力弱的蛋白，作用时间短还挂不上呢，这样晚上也可以做试验又不耽误时间而且可以同时做好几份呢，其实最好玩的是只要你测定上清和你原来样品的对比，你就知道有没有吸附，吸附了多少，一目了然，很好玩的，总比跑柱子快点。
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
4

发表于 2013-7-31 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是的，但我觉得这种办法可能仅限于亲和柱吧，因为亲和反应发生得慢，用柱子流速慢就不合适，如果把这方法用来跑疏水柱和离子柱就不行了。版主 的看法呢？
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
5

发表于 2013-7-31 13:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一样的，离子交换在工业上也有这么做的，疏水也没有问题，关键是样品要调好pH和电导，介质也这样就行，我现在也经常用阶段洗脱，这样洗脱后做电泳很容易摸最佳的条件，所以没有问题的，其实分子生物学的那些试剂盒就是用这样的方法，例如现在提取DNA质粒的试剂盒用的就是DEAE的功能基团，洗脱也是阶段的，前些日子做质粒制备的时候仔细读了试剂盒的说明书发现的。
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
6

发表于 2013-7-31 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是这样啊，谢谢了。原来是因为实验室里制备量小，所以这些高招没有用过，呵呵。。。
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
7

发表于 2013-7-31 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
何必客气，我也是从做内毒素去除的时候老这么做所以才喜欢的，以前也没有这样做，其实这样做就是浓度有时候稀而且不一定很纯，如果条件把握好了，洗得很充分，那应该是不错的方法，对摸条件其实很有用处，特别是仪器不够用的时候。
顶部
utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态 离线
8

发表于 2013-7-31 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那Qiagen 用来去除内毒素的magprep 制备大量高纯质粒也是用你提到的提DNA用的介质了？

内毒素也是蛋白，如何才能被从溶液中除去呢，是因为它们分子小吗？（我指从蛋白混合物中除去）
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
9

发表于 2013-7-31 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我对试剂盒不很熟悉，但是通常的少量去除内毒素和DNA分离是可以通过离子交换树脂分离的，但是大规模是很难的，我们试过，所以最后我们是用专门去内毒素的亲和介质去内毒素的，而内毒素主要是磷脂多糖，很复杂，它们很容易形成聚合物，所以分子量范围分部很广，因此最好的去内毒素还是用亲和吸附好点，载量大，操作简单，而且收率高，Qiagen 的magprep有很多种，我不清楚，你可以发份材料看看就知道它用的是什么原理，我主要是做下游的所以对分子生物学和试剂盒不熟悉，但是介质合成和分离原理应该熟悉点，我只对pierce 去内毒素用的是亲和，而且Qiagen 用内毒素裂解液，估计是多粘菌素吧。
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
10

发表于 2013-7-31 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Qiagen 用来去除内毒素的magprep 说可以做多大的质粒量，超螺旋比例到多少呢，很想了解一下
顶部
 21  1/3 123››