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标题:【求助】曝光时总是整张膜在发光，如何处理？

misswu61[使用道具]
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发表于 2013-7-31 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】曝光时总是整张膜在发光，如何处理？


做Western好几个月了，从连背景都没有走到今天满背景，唉.......
请高手一定帮忙解决一下：我用的条件：
蛋白质每孔200ug
12%分离胶，5%浓缩胶，85mV跑过浓缩胶，135mV跑至溴酚蓝跑出胶板
15mA转膜90min
封闭用过的条件：5%脱脂奶粉2h、10%脱脂奶粉2h、5%脱脂奶粉过夜
一抗caspase-8 bioworld的...浓度1：500，用2%BSA稀释
洗5min*6次
二抗 记不清厂家了，浓度1：500，2%脱脂牛奶稀释与否无明显区别（之前β-actin也都是这个浓度，完全没有一大坨，非常清晰的带状，很细，无背景......休息了7天以后再做，竟然β-actin也有满背景亮，只是仍然可以清晰的看见条带，很细的带......无语........）
洗5min*6次
发光5min,进口发光液
曝光.....结果.......整张膜都在熠熠生辉
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-7-31 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有几个疑问：
1. 为什么蛋白质要200微克，你的目的蛋白表达很弱吗？我们实验室一般10-80微克。
2。一抗二抗的浓度为什么这么高？合适的条件摸索过吗？尤其是二抗，非常之高了，建议你从1：10000开始摸索。一抗取决于你的抗体了。如果你的抗体浓度太高了，会有可能熠熠生辉吧（我猜）。
3。二抗之后洗的时间有点短。
4。发光液的时间是说明书建议的吗？
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发表于 2013-7-31 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗，二抗浓度调整一下
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koook5695[使用道具]
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发表于 2013-7-31 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我和楼主有同样的遭遇，我用5%的脱脂牛奶封闭2h后一抗1：500孵育4度过夜，TBST洗脱10min*3次后，二抗1：10000稀释孵育2h后，TBST洗脱10min*3次，用ECL显色，已经有三次均是整张膜发光，用DAB染色也没有条带，但是β-actin的背景正常，请各位帮忙分析一下咯，谢谢了！
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-7-31 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位，我再调调浓度！一抗的浓度无法调了，这个抗体的范围就是这样的！
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发表于 2013-7-31 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

换二抗！二抗上面的HRP都脱离了，游离的到处都是。
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2013-7-31 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你平行做了β-actin，而且β-actin那张膜曝光非常好且没有非特异性的话，说明你的蛋白，β-actin抗体，二抗都没有问题。
而你做目的蛋白却整张都是信号，那说明一抗出问题了。应该是一抗浓度过大，导致非特异性产生。
此外，你上那么多的蛋白，做WB不萃灭才怪！
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发表于 2013-7-31 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得要是你的目的条带比背景要亮的话，你可以让它萃灭30分后，在放胶片发光，就减少很多背景。并且目的条带也会清楚些，周围没有那么多的雾状东西。不过我也觉得你的蛋白量上得太大了。
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cocacola[使用道具]
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发表于 2013-7-31 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

二抗浓度太高了！！~~~~

稀释到1:5000以下试试。
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yychen[使用道具]
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发表于 2013-7-31 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有几个疑问：
1. 为什么蛋白质要200微克，你的目的蛋白表达很弱吗？我们实验室一般10-80微克。
2。一抗二抗的浓度为什么这么高？合适的条件摸索过吗？尤其是二抗，非常之高了，建议你从1：10000开始摸索。一抗取决于你的抗体了。如果你的抗体浓度太高了，会有可能熠熠生辉吧（我猜）。
3。二抗之后洗的时间有点短。
4。发光液的时间是说明书建议的吗？

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二抗的浓度会不会太低？
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