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标题:【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-7-31 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀

目前我在表达一个26k左右的蛋白，pET32a载体，可溶性表达，带有Trx标签，500mM咪唑，20mM磷酸盐，PH 7.4洗脱，因为要做EK酶切，打算把体系置换为磷酸盐缓冲体系，然后过SP去除标签，可透析后出现大量沉淀，纯化下来的蛋白质浓度大概在2mg左右，但为了保证EK酶切的效率，就没有稀释。请问这种情况该如何处理？EK酶切在有咪唑存在的情况下是否可行？另外EK酶切的温度一般在多少为好?我用的推荐使用22度16小时，但对我的蛋白效果一般，请问37度对蛋白影响怎么样？

有点长，谢谢耐心看完，寻求帮助！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-7-31 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、酶切条件：20mM Tris pH8.0,35-37度，16小时，做酶切梯度，找出最佳酶量。

2、咪唑对EK活性有影响，应该去除。透析沉淀情况不明，可能和pH有关，可以考虑提高pH。

3、酶切是融合蛋白不用做稀释，我用20-30mg/ml的浓度也一样切。

4、市场上的EK有两种，一种是E.Coli.表达，活性低；一种是酵母表达，活性高。

5、37度对蛋白有没有影响是无法事先判读的，做一次看看不就可以了吗。

6、除酶切后的标签蛋白，可以考虑再用一次Ni柱。
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-7-31 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

解答太详细了，多谢！透析我尝试了几个PH值，9.0,8.0,7.4，都不行，蛋白理论等电点是8.8,应该用多大PH。
另外盐浓度对EK酶切有影响没？谢谢！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2013-7-31 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可溶上清表达，Ni柱纯化后透析去除咪唑产生大量沉淀，这在我的经验中从来没有遇到过。能否把整个试验流程的缓冲体系讲一讲，看看怎么回事。
盐浓度都酶切有影响，高浓度盐抑制EK活性。
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-7-31 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
载体，pET32a，1mM IPTG诱导，超声破菌后离心保留上清（电泳验证目的蛋白在此）。上样buffer：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，平衡镍柱，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，20mM 咪唑洗脱杂蛋白，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑洗脱目的蛋白，也尝试过不加NaCl的。
透析液：1、50mM tris， PH 8.0,9.0,7.4
2、20mM NaH2PO4 PH 8.0,9.0,7.4
都出现沉淀。蛋白等电点大概在8.8左右，还有要提的一点是，洗脱蛋白-20度冷冻保存复溶后也产生沉淀。洗脱蛋白浓度大概在2-3mg/ml，尝试过稀释到1mg/ml左右，也有沉淀。

请帮我分析一下。另外我看园子里有用“万金油”进行蛋白透析复性的，不知道用在我这上面是否可以啊？
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-7-31 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚刚再次拜读了您之前发的帖子，发现我目前这个蛋白和你所纯化的蛋白A比较类似，我是否可以用类似的方法呢？另外就是我不知道我这个蛋白的可溶性怎么样，如果镍柱纯化下来以后脱盐置换缓冲体系，是否会沉淀在柱子上呢？
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发表于 2013-7-31 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、超声破菌buffer同上样buffer？pH？

2、20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑 这个溶液检测过pH没有？

如果回答都是yes的话，我也不知道沉淀的原因。

万金油中含有EDTA，对EK有抑制。

如果透析有沉淀，那么G25换液也很有可能沉淀。
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-7-31 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回答都是yes,PH值都是7.4，是不是就是我这个蛋白本身的溶解度的问题啊？或者说浓度太高了的原因？今天我配了点万金油，还是有沉淀，不过感觉是少了一点，明早再看看，测一下浓度再说。还有一个问题就是，我把万金油是放在透析袋的里面，最后的体系是不是就和我设置的体系一样了啊，里面的成分都可以透析掉吧？
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 小中大

蛋白在等电点的溶解度是最低的，你的是8.8，不适合用9和8吧，大概再低一些，另外你的蛋白本身是可溶还是膜蛋白，离子强度由500mM突然降到0，会对结构有很大影响的
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lixi559[使用道具]
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 小中大

你纯化的buffer中都有0.5M NaCl，但透析溶液里就只有20mM NaH2PO4？可能是离子强度不够蛋白沉淀了。试一下透析buffer中加入0.1％Triton X-100或者甘油，并且提高NaCl浓度。或者你可以在Ni柱上切啊，这样连咪唑洗脱都不用了。
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