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标题:【求助】制备抗体柱子来纯化抗原

ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】制备抗体柱子来纯化抗原

想用一种填料偶联抗体，然后再纯化细胞培裂解液或者细胞分泌上清中的抗原蛋白。因为是第一次接触，没有经验，也差了些资料，但还是有些不明白，所以想请教一下各位高手：
第一：柱子：用溴化氰活化的sepharose 4B呢还是其他的？
第二：怎么选择最佳的抗体偶联量？
第三：抗原洗脱条件要根据什么来摸索?
第四：整个实验过程还应该注意什么操作？
大家谁有比较完整的方法，请给于帮助，多谢多谢了！
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发表于 2013-8-2 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.可以.也可选择NHS活化的.2.单抗需要5mg/ml 多抗10mg/ml.3,通常免疫亲和是高pH7-8吸附,低pH2.5左右洗脱.4.不是很难,仔细看说明书或问技术支持即可.也可看一些相关的实验书，通常写的很清楚.
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ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我找到了以前别人买的CNBr-activiated sepharose 4B，上面的expiry是2007.3,不知道现在还能不能用？？
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果是密封好的，那个铝箔袋袋没有打开过，应该没有问题。
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想用一种填料偶联抗体，然后再纯化细胞培裂解液或者细胞分泌上清中的抗原蛋白。因为是第一次接触，没有经验，也差了些资料，但还是有些不明白，所以想请教一下各位高手：
第一：柱子：用溴化氰活化的sepharose 4B呢还是其他的？
第二：怎么选择最佳的抗体偶联量？
第三：抗原洗脱条件要根据什么来摸索?
第四：整个实验过程还应该注意什么操作？
大家谁有比较完整的方法，请给于帮助，多谢多谢了！

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都可以用，但偶联抗体最好溴化氰活化的，NHS活化的一般臂比较长，对于你分子量较大的抗体来说有空间位阻效应。
偶联量5-10mg（二楼已回答），可以计算一下偶联效率。
按照一般的纯化抗体的方式洗脱即可。
更换缓冲液时建议用透析，效果要优于脱盐柱。
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ssonglikihi[使用道具]
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 小中大

感谢各位热心帮助！

偶联了抗体之后，怎么存放？

如果用过一次以后，再生，会不会影响下一轮的纯化？毕竟洗脱抗原的条件会影响到抗体的活性？？
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ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是密封好的，那个铝箔袋袋没有打开过，应该没有问题。

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呵呵，锡箔纸的密封袋子打开了，但是瓶子没打开，基本上一直都是放在4度冰箱里，很久没用，突然找到的。

不知道这样还能不能用？准备先用小样量试下抗体的偶联率？
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ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果是密封好的，那个铝箔袋袋没有打开过，应该没有问题。

=================================================================================

呵呵，锡箔纸的密封袋子打开了，但是瓶子没打开，基本上一直都是放在4度冰箱里，很久没用，突然找到的。

不知道这样还能不能用？准备先用小样量试下抗体的偶联率？
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
瓶子没开过应该可以用的。
不过抗体柱纯化抗原要看运气了，不是所有的抗体柱纯化抗原都能够成功。这和抗原本身的性质以及抗原抗体的相互作用有关。
good luck.
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2013-8-2 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
> >你好，你是不是做过抗体亲和柱纯化抗原？
>
> 是啊，做过多种，有成功的，也有失败的。

呵呵，那一定经验丰富。
我现在准备做，很没头绪。能不能跟我详细说说怎么做？

1、前面已说过了，偶联看说明书。
2、最佳偶联量无法预测，只有一个个的试。一般用5-10mg/ml，但也有例外，我做的一种抗体柱就是1mg/ml最好。如果抗体经特异性的抗原柱纯化过，偶联量可以少一点。
3、抗体柱纯化抗原与抗原的性质关系很大，所以要根据抗原来选择洗脱方法。
低pH是最常用，也是最方便的洗脱方法。但如果抗原在低pH下不稳定或易沉淀（很多大肠杆菌表达的基因工程蛋白在低pH时易沉淀），可以试试2-3M的KSCN、NaSCN，或NaCO3溶液，有时候也可以尝试一下低浓度的有机溶剂洗脱，如10-30%的乙二醇，低浓度的尿素也可以尝试。
3、抗体柱的使用寿命肯定没有离子交换柱、Ni柱等长，这和抗体柱不能彻底再生以及抗体活性丧失有关。没法预测，只有一次次的做，发现吸附能力明显下降就不用了。
4、抗体的选择有人说不能选择亲和力很高的，应该选择中等亲和力的。这我觉得难以下结论，我曾经为纯化一种抗原，偶联过14种不同的单抗柱，没有规律可循。我想应该和抗原抗体的结合方式有关，但这方面我们无法得知。
5、抗体柱纯化抗原就是在吸附率和洗脱率之间取得一个平衡。吸附好的抗体柱不一定洗脱率高，洗脱率高的不一定吸附率高。

自己摸索吧，祝好运！
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