小中大【求助】同样条件,为什么我的蛋白没转到膜上呢?
我做了两次wesern blot,没有结果,而且现在我也不知道问题在哪,所以没法继续做,请大家指教!
我检测的两个蛋白分别是Slit2和robo1(125 kDa),买的一抗是santa cruz的,二抗是实验室公用的,应该没问题。
第一个问题:
slit2的一抗说明书APPLICATIONS部分写着
“Molecular Weight of full length Slit2: 200 kDa.
Molecular Weight of Slit2 N-terminal cleavage fragment: 140 kDa.
Molecular Weight of Slit2 C-terminal cleavage fragments: 55-60 kDa.”
这是不是代表我的抗体能够识别slit2的全片段、N和C末端呢?
下面简述实验过程:
上样总蛋白每孔60ug左右
浓缩胶5%,恒压100V,50min
分离胶8%,恒压150V,40min
第一次转膜条件如下:
actin转膜350mA,70min
目的蛋白转膜350mA,150min(切胶的时候是从120到250切在一块)
结果:actin 条带清晰,余未见任何条带
然后用考马斯亮蓝染转过膜的胶显示:actin 42 kDa处以上和以下都可以见条带,尤其是在55 kDa处见明显的条带
目的蛋白那块胶上见几条细细的条带
用丽春红染膜,只见actin的位置处有条带
考虑转膜时间不够
第二次转膜改变条件如下
actin转膜350mA,100min
目的蛋白转膜350mA,210min(切胶的时候是从120到250切在一块)
结果:跟上次的结果一样,actin 条带清晰,余未见任何条带
然后用考马斯亮蓝染转过膜的胶显示:actin 42 kDa处以上和以下都可以见条带,在55 kDa处仍能见明显的条带
目的蛋白那块胶上见几条细细的条带
用丽春红染膜,只见actin的位置处有条带
但是同实验室的同学50-60 kDa,转膜都只用90min,结果很好,为什么我们用的同样的机子(北京六一电泳仪),同样的电泳液和转膜液,我用了100min,55kDa处的蛋白都转不上去呢?而且第二次延长转膜时间后,结果跟第一次没有任何变化?只是单纯的转膜时间不够吗?我的转膜时间好像也不短了。还是有其他的问题?
请大家帮帮忙,谢谢了