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标题:【讨论帖】蛋白质分离纯化进展

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 小中大

【讨论帖】蛋白质分离纯化进展


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我收集了些资料，希望大家喜欢

与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小，形状，溶解度，等电点，亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。与此相对应的分离纯化方法参见表1。从表1可看出，当前蛋白质的纯化主要是依靠层析和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序，以获得较高纯度的制品。
表1. 蛋白质物化性质和分离纯化方法
蛋白质的物理和化学性质 　　　　　分离纯化方法
分子的大小和形状 　　　　密度梯度离心、超滤、透析，分子筛等
等电点和电荷 　　　　　制备电泳、等电聚焦层析、离子交换层析、　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　吸附层析等
溶解度 　　　　　　　　盐溶、盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　淀、液液萃取技术等
与其他分子的亲和性 　　亲和层析、金属螯合层析、共价层析等
亲疏水性 　　　　　　　　　疏水层析、反相层析等

1. 扩张柱床吸附技术
当重组蛋白的表达为包涵体形式时，表达量高，是近年来热门的研究项目。
但是包涵体需经过一个复杂的复性过程才可进行下一步的纯化工作。
在复性过程中，溶液的体积放大了几十倍，同时还伴随有大量的不溶性悬浮物生成。
当重组蛋白以分泌形式表达时，其发酵液中也存在着大量菌体碎片。
这些含有不溶性悬浮物或菌体碎片的溶液的处理在传统工艺上都需要经过高速离心或者过滤。
这不仅需要昂贵的离心设备，而且所费时间较长，往往成为基因工程产品下游工艺开发的限制瓶颈。
最近问世的扩张柱床吸附层析技术(Expanded Bed Adsorption Chromatography Techniques)及时地为解决这一问题提供了新的途径。
扩张柱床吸附层析技术操作原理与一般的吸附层析相似，层析柱经过自下而上的扩张及平衡后，
含菌体的发酵液或复性液从柱底部进至柱中。此时目标蛋白会吸附于凝胶上面，
一些杂蛋、菌体和不溶性的颗粒会随液流从柱顶流出，而不会阻塞其中。
再通过改变洗脱条件，目标蛋白便可从柱中洗下来。选择性地利用介质的性质，
再加上合适的缓冲液和洗脱条件，产品可以进行一步澄清浓缩纯化。
这不仅减少了样品预处理的损失，样品体积也不再是处理量的限制因素，
在缩短纯化步骤的同时，省去了大笔去购买大处理量的高速离心机及大规模膜过滤和超滤系统的经费。
由此可见，扩张柱床吸附层析技术针对基因工程产品，结合了澄清、浓缩及产品捕捉三个步骤为一体，
突破性地直接从未经任何预处理的样品中捕获靶蛋白，极大地减少了损失，降低了生产成本，提高了经济效益。
2. 径向膜层析技术
传统的层析技术往往采用长轴流向设计，虽然为广大的科技工作者运用，
但依然存在许多缺点: (1) 流速较慢，层析耗时长效率低；
(2) 层析过程中压降较大，增加了对设备的要求；
(3) 层析条件不易放大，若想放大规模，需重新摸索分离条件，为重组蛋白的大规模分离纯化提出了难题。
80年代中期国际上提出了一种称为径向层析(Radial Flow Chromatography)的新技术。
80年代后期，径向层析又结合膜分离处理量大的优点，发展成径向膜层析技术，在原理上解决了上述问题。
径向膜层析柱常采用螺旋卷式膜组件结构，流动的方向是从层析柱的圆周流向柱的圆心，即径向流动。
由于这一原理，与传统的轴向层析柱相比，径向层析有以下几个优点:
(1) 流向的截面积加大，即使在流速高时压降仍很低，因而纯化速度快处理量大。
(2) 保持柱径不变，无需改变其它分离条件，仅增加柱长就可以增加上样量，因而有利于放大生产。
3. 灌注层析技术
液相层析技术是生物分子分离纯化的重要工具，而其中分离介质尤为重要。
在过去几十年里，人们一直在提高液相层析的分离能力，以达到最好的分离效果。
谱带扩展是影响层析效率的主要因素之一，它主要源于流动相的粒子内部扩散、纵向扩散和溶质扩散这3个因子，
影响了固定相和流动相之间的传质和交换平衡速度。通常人们解决这一问题的方法是减小介质颗粒的大小。
比如介质Mini系列和Mono系列就是采用这一策略，显著地提高了层析柱床的分辨效率。然而当颗粒达到3～5μｍ时，
再提高分辨率就不太实际了。
1989年初美国的Dr. Frederick Regnier、Dr. Noubar Afeyan等人率先发明了具有贯穿孔的分离载体———POROS，
同时他们将液流通过这一载体而减小粒子内部扩散的层析行为命名为灌注层析技术(Perfusion Chromatography)。
这一技术的提出为流动相于固定相的传质问题的解决提供了新的方法。
POROS介质是在苯乙烯、二乙烯苯的交联共聚物基础上构成的，
其化学稳定性和机械强度均高于传统的葡聚糖、聚丙烯酸酯和硅胶等介质。POROS为双模式网孔结构，
在介质上有600～800nm的贯穿孔和与之相连接的80～150nm扩散孔。这一结构可以容许液体对流到分离介质的内表面，
加快了流动相与固定相的传质速度，缩短了交换平衡所需的时间。因此这一方法打破了传统的流速、分辨率和容量之间的三角关系，即在流速增加的情况下柱容量和分辨率均不会降低，且反压也不会升高，为快速纯化生物大分子提供了基础。
由于灌注层析技术的原理只是增强了传质的动力学过程而不改变层析的分离原理，
因此它可以运用于除凝胶排阻层析之外的所有层析技术中。鉴于灌注层析技术的快速高效性能，
它的推广是蛋白质纯化技术发展的必然趋势。
4. 置换层析技术
置换层析(Displacement Chromatography)是非线形层析技术中
(即被分离的物质在流动相与固定相之间不是线性关系而是呈其它函数关系)唯一可实际应用的技术，
其基本原理是利用置换剂置换出吸附在层析柱的被分离组分。
置换层析与传统洗脱层析都是利用样品组分对固定相的亲和能力不同将各组分分离，
但两者的工作原理却大相径庭。
传统的洗脱层析是由于各分离组分在流动相与固定相之间的分配平衡常数不同而引起的各组分在流动相的迁移速度不同达到分离目的。
而置换层析的分离原理是被吸附的各组分对固定相吸附部位的直接竞争作用的结果，
依据与固定相的亲和性不同在置换剂的推动下，形成一系列已分离的置换序列。
置换层析与传统洗脱层析的比较见表2。重组蛋白质的纯化经常会遇到如下问题，
即虽经过多次不同层析技术的分离，目标蛋白中仍有无法去除的杂蛋白，这些杂蛋白在分子量大小和所带电荷数均极为相似，
有的甚至就是目标蛋白的折叠异构物。因而极难除去，常令纯化工作者头疼。
利用置换层析这一具有高分辨率的方法常常可以起到特殊的效果。
1997年，Amitava Kunda和Steven Camer报道利用小分子量的置换剂将离子交换层析和分子筛层析不能分离的牛细胞色素Ｃ和马细胞色素Ｃ完全分开。
此外，置换层析的另一大优点是在如此高的分辨率的情况下依然保持很高的上样量，
这无疑为重组蛋白的生产提供了有效的手段。

表2. 置换层析与传统洗脱层析的比较
　　　　　置换层析 　　　　　　　　　　　传统洗脱层析
分离机理 　　被吸附组分之间对　　　　吸附的平衡常数不同导致各
　　　　　　固定相亲和性大小不同 　　组分在流动相中有不同的速度　

洗脱峰形 　　矩形的平台洗脱峰形 　　　　　钟罩形洗脱峰形
上样量 　　饱和吸附量的40%～60% 　　　　饱和吸附量的5%
样品在洗 　　浓缩状态分离 　　　　　　　　稀释状态分离
脱后的浓度
有无拖尾 　　　　　　无　　　 　　　　　　有
分辨率 　　　　　　极高 　　　　　　　　　　　高
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发表于 2013-8-2 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
诚然，目前置换层析也有许多局限性1)由于置换层析技术要求被分离蛋白质附和Langmuir吸附等温线，
如不同蛋白在同一吸附剂上的等温线有交叉时，置换层析的分离效率就会大打折扣。
(2)由于在分离过程中各组分形成相互接近的的置换序列，就会在彼此相邻的交界处发生洗脱峰的重叠现象，
影响样品的回收率。(3)由于置换层析中的浓缩作用，许多蛋白质在超过一定浓度的界限时会聚集形成沉淀，造成层析柱堵塞。
鉴于置换层析技术的上述特点，国内外许多学者都认为它将成为基因工程下游技术中最有效的制备性生物物质分离技术之一。
今后的研究工作将会集中在不断探索研制低价无毒而高效蛋白质置换剂，适合置换层析技术的新型吸附材料上。

5. 金属螯合亲和层析的新运用
目前金属螯合亲和层析(Metal Chelate Affinity Chromatography)所采用的螯合剂主要有两种:
一是亚氨基二乙酸(IDA)，另一个是次氨基三乙酸(NTA)。它们都可以有效地与Ni、Zn、Cu和Co等二价金属离子发生螯合作用，
从而将金属离子牢固地结合在介质上。
在层析过程中，这些二价金属离子又可以螯合溶液中蛋白质分子外露的组氨酸等氨基酸残基簇，将蛋白吸附在介质上。
洗脱时，通过改变ｐＨ，加竞争的螯合试剂等方法，依据各蛋白组分与介质的亲和程度不同将目标蛋白与杂蛋白分离。
因此具有分辨率高选择性好的特点，给分离蛋白质带来了很大方便。
金属螯合亲和层析的另一个优点是层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化又可以应用于含6M盐酸胍或8M尿素的变性条件。
这一优点尤其对以包涵体形式表达的重组蛋白纯化尤为有利。但是在实际应用过程中金属螯合亲和层析也遇到一些问题。
在过去，金属螯合亲和层析填料大都采用琼脂糖为介质，而琼脂糖颗粒表面较为粗糙，容易产生一些非特异性吸附现象。
这一现象尤其出现在小量蛋白的分离或含疏水性蛋白多的情况中，而且也不适应快速分离蛋白，
大大影响了金属螯合层析的分离效果。针对这一情况，90年代以来国外的一些科学家采用磁化或超顺磁化介质克服了这一缺点
含有氧化铁的交联琼脂糖是常用的磁化填料，它们的颗粒非常细，表面极其光滑，将蛋白的非特异吸附降到最低的水平。
近年来，人们还将基因重组技术与金属螯合层析结合起来，在基因水平上为蛋白质的分离纯化提供方便。
其基本原理是在目的基因的Ｎ端或Ｃ端加上6个His，这样表达出的蛋白就可以直接用于金属螯合层析当中。
目前一些公司已推出商品化的试剂盒，美国Qiagen公司提供的QIA express系统就是很好的一例。
该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等成分，
可以将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合层析进行分离，
有时可取得一步纯化的效果。依据蛋白质空间结构，
从基因水平考虑重组蛋白的纯化为今后蛋白质分离纯化途径提供了新的思路和方向。
也有些公司根据抗体与抗原的亲和作用，将抗原与目的蛋白组成的融合蛋白表达，
再利用结合抗体的亲和柱分离目标蛋白也取得同样好的效果。
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发表于 2013-8-2 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Ni-NYA纯化原理
本试验所用的固定化金属配体亲合层析（IMAC）技术，是利用了多聚组氨酸（His）及某些蛋白质与过渡金属（锌、铜和镍）的高亲合力结合，形成了一种完全不同的融合载体多肽和纯化介质。次氮川乙酸（NTA）含有六个配位键，有四个可以和镍离子螯合，形成稳定的螯合物，保证其在严格的洗涤条件下能够稳定结合，使融合表达产物在更为严格的条件下进行，甚至可以允许在少量还原剂存在的条件下纯化，只需一次过柱，就可以分离目的蛋白，使蛋白的纯化率达到95％以上（Hochuli.1989;Janknecht et al.1991）。在N端设计的6个连续组氨酸残基作为亲合臂，其免疫原性比较差，在pH8.0的环境中，容易失活，因此不会影响纯化后蛋白的结构和功能（许正平等，1997）
与其他亲合层析纯化系统相比，IMAC系统有其独特的优点，如树脂（Ni-NTA）稳定性好，容量大（吸附蛋白量为5－10mg/ml）,洗脱条件温和，再生方便。树脂与6×His融合蛋白的亲和力极高，使得非专一性吸附的杂蛋白可在较为严格的条件下洗脱，而不会影响6×His融合蛋白的结合。另外，由于6×His融合蛋白与树脂间的结合不需要任何功能结构，因而与依赖抗体/抗原/酶/底物相互作用的融合纯化系统相比，6×His融合表达系统不仅可以在天然状态下纯化可溶性的表达产物，而且可以在变形状态下纯化不容性的包涵体表达产物，在变性条件下纯化的蛋白可以直接通过稀释变性或在柱上折叠（Bugge et al.1992）。
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发表于 2013-8-2 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：以上的方法是不是都不能保持蛋白质的生物活性啊？另外，如何能够保持活性分离蛋白？是不是只有离子交换层析，凝胶过滤层析，制备型天然page电泳？ 谢谢！
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发表于 2013-8-2 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问制备常规单抗用的抗原（原核表达）都用什么纯化方法？
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 小中大

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亲和层析技术研究进展
（刘望才 化工学院 D040503）
摘要： 亲和层析具有高选择，高活性回收率和高纯度等特点已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一．本文综述了亲和层析技术及其发展趋势。
关键词：亲和层析 配基 研究进展
Research and development of affinity chromatography
（Wangcai Liu ，the Institute Chemical Engineering，D040503）
Abstract：Affinity chromatography is one of the most efficient techniques in biologic macromolecular separation and purification which has the advantages of high specificity，high recovery efficiency，high purity and so on．The types and development of affinity chromatography are introduced。
keyword： Affinity Chromatography，ligand ,review
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等[1，2]。
亲和层析技术的最大优点在于．利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。利用亲和层析技术成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品[3]，亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。
近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲相层析技术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最重要的方法之一[4，5]。
本文讲述了亲和层析的技术要点，介绍了免疫亲和层析、金属离子亲和层析等主要的亲和层析方法，还介绍了各种亲和层析联用技术。
1 亲和层析的一般问题
1．1 配基的选择
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶载体相偶联制成亲和吸附剂，这样一对生物分子中，被偶联的一方就叫作配基。在实际工作中，究竞选择哪一种物质作配基，要根据分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质，选择与其专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白，选择相应的激素做配基，纯化核酸可以根据核酸与蛋白质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、DNA和R14A之间杂合作用的关系选择合适的配基[5]。
1．2 载体的选择
将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。因此，亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应满足下列要求[3，5]：(1)具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；(2)物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；(3)含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；(4)粒径均一的球形粒子。常用的亲和层析载体有：琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶、纤维素、多孔玻璃等。其它用于载体的物质还有：聚苯乙烯、淀粉珠、壳聚糖、硅胶等。
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 小中大
1.3 基质活化和偶联
大部份基质在偶联抗体之前，均需要进行化学活化。活化基质通常经过与抗体表面残基的—NH反应将抗体偶联，偶联反应也可通过与抗体表面的一0H、一C00H或一NH进行。
在小配体的亲和色谱中，间隔臂常插在基质和配体之间，以尽量减少空间位阻对蛋白质与其配体相互作用的影响[6]。当配体本身就是蛋白质大分子，因此，空间位阻将不会阻碍抗体与抗原的相互作用。
最常使用的基质活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多糖类基质具有简单、效果好的特点。许多活化好的、稳定的基质已商品化，在仅仅需要少量基质时可以购买。如果基质的需要量大，自己进行活化更为经济。
1．4 洗脱问题
洗脱亲和吸附剂上吸附的物质大多采用非特异洗脱的方法，通过改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定化配基和生物高分子之间的亲和力降低，以至解开生物高分子和亲和吸附剂之间的结合。假如那些纯化对象和亲和吸附剂的亲和力不强，当连续通过大体积的平衡缓冲液时，便可在紧随杂蛋白洗出蜂后，得到纯化对象的组分。对于那些吸附得比较牢固的大分子，必须用较强的酸或碱作为洗脱液。也可以用特异洗脱的方法，利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。另一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这一特点，当吸附生物大分子以后，可以用还原剂断裂重氮键或断裂硫脂键，从而得到生物大分子和配基的络合物，然后将络合物解离，再分出欲纯化的生物大分子[5，6]。
1.5 应用举例
刘卫刚等[7]用脂多糖亲和层析柱吸附抗脂多糖抗体取得了比较好的效果。向文斌等[8]认为免疫亲和色谱能在核糖核蛋白中的纯化中的得到很好的应用。
2 免疫亲和层析
抗原和抗体的作用具有高度的专一性，并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上，便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。
2．1 抗体的纯化
抗体在亲和层析试剂中所占地位日趋重要，所以纯化抗体的方法也倍受关注。抗体通常是从血清、杂交瘤上清或腹水中获得[9]。
2．2 抗原的纯化
在蛋白质纯化中用抗体亲和纯化抗原是非常有效的方法。一般纯化倍数可达到1000~10000倍。如果抗体与目的蛋白的结合的特异性得到证明，并且经过洗脱的目的蛋白没有受到可逆的损伤，那么抗体亲和纯化将是理想的蛋白质纯化方法[10]。
抗体亲和纯化的质量很大程度上取决于抗体溶液的纯度，制备亲和柱的抗体既要良好的特异性和活性，又要尽可能的纯。抗体亲和柱的制备是相当昂贵的，其结合容量却相对较低。因此为了节省和提高效率，经常制备的是小而粗的柱子，同时在亲和纯化步骤里要求样品溶液重复几次上样，以便纯化更多的抗原蛋白。此外，较小的柱子也可以减少和限制柱污染和抗体丢失。
2.3 应用举例
免疫亲和色谱在实验室被广泛用于蛋白质的分离纯化，目前IAC在治疗产品大规模生产上的应用受到价格、配体的渗漏和IAC吸附剂抗原结合容量低等问题的限制。单抗问世后、不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤细胞的生物反应器及其培养基，这些大规模生产单抗技术的建立和不断完善将降低IAC吸附剂的价格[10]。随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对IAC研究的深人，必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质的应用逐渐得到发展。
赵益明、何杨[11]等用单克隆抗体亲和层析从人血小板破碎液中纯化血小板第4因子(PF4)。将单克隆抗体Sz—95—LgG与溴化氰活化的Spharose 4B凝胶连接成亲和层析柱Sz—95—LgG—Spharose 4B，人血小板破碎液经此亲和层析柱上样后，经洗脱获得PF4。结果表明，Sz—95—Sepharose 4B亲和层析柱的偶联率为72％，每1m1血小板破碎液中可以纯化到PF4 18ug，其相对分子量约为12kD，经点印迹显示与单抗Sz—95反应显带。该层析柱纯化败效果较好。
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3  金属离子亲和层析
3．1 基本原理[12]
组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团可提供电子，与金属离子结合。当这些氨基酸残基与金属离子结合后，含这些残基的蛋白质在亲和层析柱中受到阻滞。用螯合剂将金属离子固定在固体表面会减少蛋白质—金属相互反应的自由度，蛋白质也因此不容易失活，在后继的分离纯化过程中仍然保持较高活性。
3.2 固定化金属离子亲和层析柱的制法[13,14]
将柱子浸没于某种金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、CO2+)缓冲液中，直至螯合到固定相上的金属离子和溶液中的金属离子达到平衡。固相载体，通常是多聚物(如交联化的琼脂糖，葡聚糖)，配位体(亚氨基二乙酸，IDA)共价连接．当在缓冲液中浸泡平衡后，经洗涤，可将含有生物活性物质的样品上柱，与固定化金属—配基有亲和力的分子都将被滞留，其余则流出柱外。
3.3 固定化金属离子亲和层析的优点
和传统的亲和层析相比，固定化金属离子亲和层析具有以下优点[12]：(1)配基稳定性高，不易脱落；(2)金属离子配基价格低廉，再生成本低；(3)可在高盐浓度下操作，从而省去了脱盐的预处理步骤，而且可以减少非特异性吸附；(4)蛋白质洗脱比较容易，采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑,EDTA,便可将吸附蛋白解吸下来。
金属离子亲和层析是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力来吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的基、色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。锌和铜己发现能很好的与组氨酸的咪唑基巯基结合[10]。常用的金属离子有Cu、Ni、Zn、Co等。金属盐的种类和结构，流动相的组成、PH值、离子强度等会影响亲和层析的效果。
金属离子亲和层析具有以下优点[14]：(1)蛋白质吸附容量大，是天然配基结合量的1O—100倍：(2)价格便宜，投资低：(3)具有普遍适用性．金属离子配基具有很好的稳定性，吸附容量大，成本很低，且层析柱可长期连续使用，易于再生。
3.4 固定化金属离子亲和层析的缺点
但是，金属离子亲和层析与免疫亲和层析比较起来，对蛋白质的特异性差，会发生非特异性吸附，结合常数K在104～105之间．另外，螯合在亲和载体上的金属离子在操作过程中有可能脱落而混入产品中，严重影响产品质量螯合。
3.5 应用举例
王雪蜂、陈美 [15]等从虾壳制备所得壳聚糖为基质合成金属整合亲和吸附剂，用于纯化猪血铜锌超氧化物歧化酶，得到比活为4756U·mg/1的酶蛋白，收率为67％，纯化倍数为61。聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色定位表明，经整合层析纯化后的酶纯度基本均一。
Larry Riggs等[16]设计了一种利用多级层析分离蛋白质的方案。其中所用的亲和层析柱为Ca(III)—IMAC系统。利用磷酸化肽与Ca的亲和能力，研究人员用该柱选择性的结合被胰蛋白酶消化的牛奶中的磷酸化肽，效果良好。
4 拟生物亲和层析
传统的单克隆抗体及天然大分子有高度专一的立体结构，是较为理想的亲和介质，但这些大分子本身需要高度纯化，成本昂贵且生物化学性质不稳定，纯化中难以维持结合活性，近年来发展起来的仿生亲和小分子配基新技术，对于纯化的目标蛋白在组合生物分子库和组合化学分子库中筛选其相应的亲和配基，然后将其固定到支持介质上，这种组合出来的亲和配基比天然生物分子性质更稳定，特异性及重复性更好[17,18]。
拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附分离目的蛋白质的亲和层析，尤以氨基酸(包括多肽)亲和层析和染料亲和层析为代表．
4.1 染料配基亲和色谱
染料配基能通过共价链牢固地结合到亲和载体上。染料配基价格低廉，与蛋白质的结合容量大，并且不易为物理或化学物质所降解，因此是一种较为理想的基团特异性配基，如王静云等用染料配基亲和层析纯化了碱性磷酸酶[19]。
S．C．MeLissis等[20]研究了谷胱甘肽结构类似物亲和吸附剂。所用的染料是二氯三嗪的模拟物，其中活性部分结构与谷胱甘肽类似。用此种亲和吸附剂分别纯化三种作用于谷胱甘肽的酶NAD十、甲醛脱氢酶和谷胱甘肽—S—转移酶，效果良好。
活性染料对蛋白质分子特异性较低且染料配基通常是有毒性的，且与蛋白质会发生非特异性相互作用。透过实验找到一种与特定目的蛋白很好结台的染体配基是可能的，但是产品回收纯度不高，特别是当分离复杂的体系时．难度更大。
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4.2 多肽亲和层析
多肽是亲和层析纯化生物大分子更有效的配基。因为它只含有一些氨基酸，所以即使脱落进入产物中也不会产生免疫反应。多肽配基与抗体配基比较起来稳定性更好．它们能在GMP条件下进于大规模的无菌生产，这样可以大大降低成本。与金属和染料相比，多肽具有较高的特异性，且通常是无毒的。多肤具有与蛋白质相似的结构，因此它们的作用通常是温和的，因此在分离过程中可以采取温和的洗脱条件，可以避免蛋白质的变性.
H．Arostova[21]等用碘化的L—酯氨酸与琼脂糖交联制备亲和层析柱纯化猪胃蛋白酶，效果良好。John等[22]合成的双环八肽类似物，对肠促胰酶肽有很好的特异性吸附。与金属配基和染料配基相比，多肽具有更高的特异性，且通常是无毒性的。由于与蛋白质结构的相似性．它们之间的相互作用通常是温和的，因此在分离过程中可以采用温和的洗脱条件．避免了蛋白质的变性、失活。然而，自然界中存在的与蛋白质等生物大分子有天然亲和性的多肽种类非常有限。因此，必须找到并得到合适的特异性多肽。组合化学的进一步发展[23]将为这一发展方向开辟道路。
5 亲和色谱和其他技术联用
从发展趋势来看，生物分离技术研究的目的是要缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率。过程集成(Process Integration)是一般化工加工过程的重要研究方向[24]。有学者指出[25]:生物分离过程高效集成化的含义在于利用己有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成)，或者把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。下文文将对一些集成化的亲和层析技术分别进行介绍。
5．1 离子交换—亲和色谱分离纯化[24]
据调查，在单步纯化效果的工艺中有45％是采用亲和技术获得的。而通过离子交换和
亲和色谱的配合使用，还可使纯度提高1000倍以上 (达98％以上)，进而满足高效分离纯化的生产要求，同时也为现代药物的研制提供了便利。
人脾组织提取物或人胸腺组织提取物经DEAE—52纤维柱作用后的物质泵入抗SSA抗体亲和柱(抗SSA血清的特异性IgG结合到CNBr活化的sephaMse 4B柱)，洗脱物即为可溶性核糖核蛋白SSA，其效果要大大好于单用亲和色谱[26]。
5.2 亲和膜分离技术
亲和膜分离(Afinity Membrane Separation)是将亲和层析与膜分离技术结合起来以提高过程选择性的一项新型分离技术[27.28]。膜分离是根据分子大小不同来实现分离的，一般相对分子质量相差10倍以上的物系才具有分离作用，因此它还远远不能满足生化分离的需要。而生物亲和作用也存在载体价格昂贵;色谱柱易堵塞和污染等许多难以克服的缺点。亲和膜分离技术，综合了两种方法的优点，而且相互互补克服缺点，具有传质阻力小、压降低、设备体积小、配基利用率高等优点[29].但在使用过程中存在着膜的污染和膜孔堵塞等现象，这些现象的出现会使膜的分离效率下降、寿命缩短.
亲和膜过滤技术研究的最早报导见于1980年。Patrick Hubert等人将雌二醇作配基连接于水溶性载体Dextran-72000，用于从Pseudomonas testosteroni提取物中纯化酮醇异构酶，截留率为90%，但杂蛋白的截留率也较高，这可能是由于目标产物与杂蛋白形成复合物或配基与杂蛋白结合所致[30,31]。近年来，国内外学者在亲和膜分离技术的研究上取得了令人注目的进展，己报道用于胰蛋白酶[32]溶菌酶[33]、胆红素[34]、血清中内毒素[35]等的分离纯化。
5.3 电泳亲和层析技术
电泳亲和层析技术(Electrophoresis Affinity Chromatography)是将电泳与亲和层析相结合形成一种新型制备规模的生物分离技术[36]。其基本思想是利用电场强化扩散过程以加速分离过程的进行，从而避免了亲和层析在分离过程中，由于液相主体中的溶质分子必须经过一系列扩散过程才能进入到固定相颗粒孔内完成吸附或解吸等质量置换反应，且被置换出的物质再由颗粒内扩散出固定相颗粒进入流动相而引起的分离速度缓慢的缺点。刘铮等[37]发现亲和色谱过程施加电场后吸附过程的传质速率加快，动态吸附容量提高
5.4 生物磁性亲和分离技术
磁性亲和分离技术将磁性介质引入亲和分离技术，已在细胞分离、固定化酶、免疫检测、DNA分离等诸多领域中得到了应用[38].它可直接从初始样品液体中(无论是浑浊或清亮液)分离目标产物，克服了传统色谱方法需要离心和过滤除杂质的步骤;此外，同亲和色谱一样也具有高的特异性及应用范围广等优点。
磁性分离技术中引入磁性介质，在操作时通过外加磁场的作用。可以提高传统生物分离技术的效率。孙敏莉等[39]对磁性颗粒在DNA分离与纯化中的应用作了详细的综述.郭立安等[40]合成了能用于万古霉素纯化用的磁性亲和载体，并从发酵液中一步纯化得到，可使纯度达到97%以上的纯品。Safank等[41]则探讨了利用磁性颗粒进行细胞分离的方法。
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5.5 膨胀床吸附层析技术
众所周知，与上游过程相比，生物下游处理过程是一个多步骤、高能耗、低效率的过程。而且，分离的步骤越多，产物的收率就越低，而生产成本则越高。因此，开发高度集成化的新型生物分离技术，用一步或少数几步操作获得过去需要很多步才能达到的效果，是当务之急.传统层析过程的最大不足是不能处理含固体颗粒的料液，20世纪90年代产生的膨胀床吸附技术(Expanded Bed Adsorption. EBA)将固一液流态化技术与层析过程祸合，使吸附和淋洗过程大大加快，细胞碎片等不溶物从顶部排出，实现了离心、过滤和纯化的一体化操作[42]。
综上所述，亲和层析联用技术虽然相对来说不是很成熟，但有着广泛的发展前景。
6 展望
亲和层析技术以其高选择性和可逆性开创了生化分离的新纪元，亲和层析技术具有高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点，广泛的应用于生物大分子的分离纯化。特别是对含量极少的基因工程产品的一步纯化，更显示出这一技术的优越性．随着临床对药用蛋白等生物工程产品需求的不断加大，这对生物下游的分离技术的发展，尤其是亲和层析技术的发展将具有非常大的推动。
亲和层析也有一些缺点，主要是载体(如琼脂糖)价格昂贵，机械强度低；配基制备困难，有的配基本身需要分离纯化；配基与载体偶联条件激烈等。要解决这个问题，关键是找到合适的配体。这些配体要有价格合适、机械强度高、制备容易、容易偶连等特点。组合化学、基因工程等科学技术的高速发展，将大大推进亲和层析技术向前发展。
亲和层析技术和其他分离技术的结合，虽刚发展，但将在生化分离中得到广泛的应用。
参考文献
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