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标题:【求助】蛋白表达量太低，咋办？

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发表于 2013-8-3 09:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达量太低，咋办？

各位做过原核表达的朋友，我用的是PGEX4T-2作载体，转化DH5a菌。37度诱导表达量不高，查过资料后用25度、42度，反正改变温度反而不表达了。我是测过序的，保证读码框架正确。请高手快快不吝赐教，我快急疯了！
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发表于 2013-8-3 09:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜蛋白？
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发表于 2013-8-3 09:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PGEX宿主菌应该都是BL21吧？
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发表于 2013-8-3 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GST载体再DH5 a 表达也可以，但是通过优化条件提高产量，几乎都会失败，建议采取大量培养的方法来解决。
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发表于 2013-8-3 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位，我表达的是一种细胞因子的嵌合蛋白，并非膜蛋白，单独表达细胞因子是时用的相同的载体和宿主菌，表达的不错，谁知Linker上一段短肽后表达的这么让我伤心。
楼上，你是说大体积诱导，用柱子浓缩吗？
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发表于 2013-8-3 09:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议换成BL21作宿主菌试试。
据说有时原核表达需要不断的试各种宿主菌和不同的克隆。不同的克隆表达尚且会有不同，更不用说你还Linker上一段短肽了。
祝好运!
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发表于 2013-8-3 09:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，我觉得也好换宿主菌了，每个实验室都有自己的传统，我们实验室一直以来都用pGEX4T-2做表达载体，DH5a作宿主菌，就没尝试过其他的载体和细菌，早就听说PET/BL21系列不错了。还想问一下，含有重组质粒的BL21是不是不好做甘油管保存？
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发表于 2013-8-3 09:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

pGEX用BL21保存很容易丢失，表达的时候转化BL21。
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发表于 2013-8-3 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Linker上一段短肽，具体一下可以？
短肽如在C端，且疏水，一般蛋白表达量低。
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#甜#[使用道具]
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发表于 2013-8-3 09:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我连的是七十几个bp的短肽，用的是（GGGS）3做的Linker，目的是协同细胞因子的作用。但是我是在N末端连的，其疏水性也较高。试着换了JM109、RSST Blank菌表达结果还不行。真不知道是不是两个肽有相互作用而使表达量下降？
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