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标题:【求助】双向电泳图，求指教！水平条纹严重

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发表于 2013-8-3 10:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】双向电泳图，求指教！水平条纹严重


水平条纹非常严重，不知什么原因，是上样量太大吗？


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2013-8-3 10:03
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2013-8-3 10:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
光一个图不好去分析

楼主要把实验条件附上，包括蛋白质的提取、处理、水化、IEF、平衡、SDS-PAGE、染色过程等。

2-DE操作复杂，影响因素也很多，光一个图不能说明什么
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发表于 2013-8-3 10:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 68943512yao 于 2013-8-3 10:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
光一个图不好去分析

楼主要把实验条件附上，包括蛋白质的提取、处理、水化、IEF、平衡、SDS-PAGE、染色过程等。

2-DE操作复杂，影响因素也很多，光一个图不能说明什么 ...

蛋白提取就是7M 尿素，2 M 硫脲，然后超声破碎，之后纯化上样，上样量1mg左右，水化是50 v主动水化，IEF 200 V 线性一小时，快速1小时，500 v线性一小时快速1小时，1000 V线性2小时，快速一小时，8000V 线性5小时，然后是 8000V 60000vh。后SDS-PAGE, 10 mA 1.5 h, 30 mA.

胶体考染法染色。固定4小时，过夜染色。
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发表于 2013-8-3 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、典型的聚焦不充分，a.也许样品中盐离子浓度过高，上样前可以脱盐处理一下;b,也可能是核酸浓度高,楼主在提取样品时，样品是否很粘稠，如果是的化，可以加点核酸酶。超声可破碎核酸，但个人觉得作用效果有限

2、上样量可以适当降低一下，700ug应该够了

3、问一下你实验的具体情况，裂解液中加缓冲盐没？纯化上样具体步骤是什么？在做IEF时，达到了聚焦电压8000V没？
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发表于 2013-8-3 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得是样品中盐离子浓度过高，或者是除盐不充分，上样前可以脱盐和浓缩处理一下。
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发表于 2013-8-3 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、典型的聚焦不充分，a.也许样品中盐离子浓度过高，上样前可以脱盐处理一下;b,也可能是核酸浓度高,楼主在提取样品时，样品是否很粘稠，如果是的化，可以加点核酸酶。超声可破碎核酸，但个人觉得作用效果有限

2、上样量可以适当降低一下，700ug应该够了

3、问一下你实验的具体情况，裂解液中加缓冲盐没？纯化上样具体步骤是什么？在做IEF时，达到了聚焦电压8000V没？

======================================================

我用伯乐的试剂盒纯化过了，上样量我也感觉大了，下次改成500 ug试试。
裂解液中没有加缓冲盐。聚焦电压到了。
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发表于 2013-8-3 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得是样品中盐离子浓度过高，或者是除盐不充分，上样前可以脱盐和浓缩处理一下。

==========================================

我用伯乐的纯化试剂盒纯化过了，以前没有发现这种情况。
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 小中大
我的解决了，是核酸没有除干净，纯化的时候出了点问题，除净核酸就好了。
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发表于 2013-8-3 10:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你用的核酸酶是BENZONASE? 你的核酸酶如何使用的？
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原帖由 qumm1985 于 2013-8-3 10:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问你用的核酸酶是BENZONASE? 你的核酸酶如何使用的？


我用的是benzonase，就是在破碎细胞前加入50 U每ml。但是我感觉核酸酶的作用似乎并不是特别明显。因为加入核酸酶作用后，溶液仍然是粘的（粘稠度有降低），只有在超声之后，溶液才会澄清而且不粘。

我感觉纯化的作用可能比较重要。我是改变了一下纯化的方法后解决了问题的。我原来对纯化步骤中有一点理解错了。
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