小中大【求助】Western可以做出 ERK,却做不出P-ERK,
我购买的抗体(ERK1/2,P-ERK)是CST公司的
我的目的是裂解细胞,检测这两种蛋白的表达。我现在碰到的问题是:ERK1/2出结果了,而p-ERK1/2做了2次了,没有结果。我把我的步骤给您看一下,请您帮忙分析一下,谢谢。
1) 取老鼠大脑组织用细胞裂解液(买的,含PMSF,磷酸酶酶抑制剂),冰上研磨,研磨后,在15000*6min, 4℃,取上清,分装,放于-80°冰箱保存
2) 跑SDS-PAGE,之前用2倍的上样buffer煮5min,一部分胶用于考马斯亮蓝染色,一部分胶用于转印,染色后的胶,目的蛋白含量高(说明提纯蛋白这个步骤没有问题),转印也较完全(用的预染marker做对照)
3) 我用的是PVDF膜(millipore),先用甲醇泡3min,,转完后,先放入TTBS(10mM Tris+0.9%Nacl, PH 7.5)洗一下,再用5%脱脂奶粉(1*TTBS配)室温1h,TTBS洗,再加一抗p-ERK(1:500,稀释液用5%的BSA),4度过夜,TTBS洗,再加二抗抗兔的(1:1000,稀释液用TTBS),TTBS洗,DAB显色(试剂盒)。一片空白!
4) 我做的ERK1/2,步骤完全同前,出来结果了!
上面就是我的步骤与碰到的问题,请各位师兄师姐帮忙分析一下,抗体估计没有问题,而且这个动物模型取的时间点是有PERK表达的,是不是因为我的操作哪个步骤有问题?
万分感激!