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标题:【求助】Western blot：细胞色素C检测不出来？

zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western blot：细胞色素C检测不出来？

我用药物诱导细胞凋亡后，收集细胞，制备细胞裂解液后（常规方法制备，可能不包括线粒体中的蛋白），用15%的SDS-Page分离蛋白，然后15V，80min转0.22um的PDVF膜，1抗室温孵育2hr，2抗室温孵育1hr，然后显色观察。没有发现任何细胞色素c的条带出现。由于转膜后我的PDVF膜上存在5kd，10kd以及15kd的蛋白marker，所以个人推测转膜应该没有问题，因为细胞色素c大约为14kd左右，所以应该也能转上。但是为什么没有条带呢？
再补充一下：我以前做过活化的caspase-3的western，其分子量大概17kd，19kd，用上面的方法是可以检测出来的，但是为什么细胞色素c检测不出来呢？他们的分子量差不多啊。
注：转膜后发现与膜接触的那张滤纸上有10kd 的蛋白marker痕迹，是不是过转了？

请大家帮助我。在线等。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你怎么制备蛋白？是只收集了细胞液？可能不包括线粒体中的蛋白？？
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是按每个样品加50ul裂解液（RIPA，PMSF，cocktail）然后吹打30次，冰上静置10min，高速离心20min，再冰上静置10min，蛋白定量后加loading buffer，99度加热5min离心后-20度保存。
这是我们实验室的常规制备方法，检测其他蛋白时都不错。就是细胞色素c搞不出来。怎么回事呢？
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leifengta[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
正常情况下，Cytochrome C 位于线粒体内膜，裂解液中要含有约1% Triton X-100，并充分匀浆才有可能溶解下来。建议使用全细胞裂解液，即SDS-loading buffer去裂解细胞，效果更好。
细胞凋亡时，Cytochrome C有可能释放到胞浆，经常有人检测这一部分的Cyt C作为apoptosis的依据。但是这一部分的Cyt C量很少，要加大上样量。
我不清楚Caspase 3的亚细胞定位，如果和BCL2 及Bax一样，那就位于线粒体外膜上，朝向胞浆，比较容易提取。
此外，Apoptosis情况下，释放到Cyt C的量也是微乎其微的，建议使用更大的蛋白质上样量，缩短转膜时间（分子量较小），加长一抗孵育时间至2-3hrs，可以增强信号。因为即使以前我们制备线粒体，并以Cyt C作为control,信号也不是很强。
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：是不是分子量越小的蛋白转膜速度越快啊？而大分子量的蛋白转膜速度慢呢？如果转膜时间过长，会不会导致小分子量的蛋白转到滤纸上了。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 zhihui小新 于 2013-8-3 15:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问：是不是分子量越小的蛋白转膜速度越快啊？而大分子量的蛋白转膜速度慢呢？如果转膜时间过长，会不会导致小分子量的蛋白转到滤纸上了。

很对
小分子量可以用半干
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 如果你在滤纸上看到了maker，就表示很可能就是转过去了。
你做这么小的蛋白，PVDF膜的孔径多大呢？
最好用0.2um那种，一般不会转过去的。
如果你用的是0.45um的甚至更大的，就有可能转过去。所以下次你可以转膜轻点试试，滤纸上不能看到marker为好。

2. 你确定你的 primary antibody 没问题？ 最好有个control，如果你从来没有用该抗体看到过条带，说明抗体的原因也得考虑考虑，不是吗？
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zhihui小新[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的抗体是cell signaling的，应该没问题吧？
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S6044[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位师兄，我想问一下，说明凋亡时，匀浆怎么排除线粒体中的cytc的影响，就只能证明你wb的是胞浆中凋亡释放的cytc呢
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windy+++[使用道具]
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发表于 2013-8-3 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

使用线粒体胞浆分离试剂盒提取线粒体和去线粒体胞浆，然后分别检测细胞色素c，如果线粒体中减少，胞浆中增加可以证明细胞色素C的释放。
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