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标题:【求助】KLH和12肽偶联后如何证明它们已经偶联成功了

shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】KLH和12肽偶联后如何证明它们已经偶联成功了

各位老师大家好：
请问下面的问题，我有一个12肽N端有一个CYS，要做成完全抗原来做免疫用的，用pierce 的MBS试剂盒可以把肽和KLH偶联成功，想请问用什么方法可以鉴定是否偶联成功，不知道各位有没有成功的方法。现在有很多公司都是这样做的，说明一下KLH的分子量有大约几百到几千KD，分子量非常大？
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owanaka[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
BSA可以跑胶看偶联效果，KLH好像没有什么方法检测，不知道有没有其他人知道，期待。
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woshiduiyan[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以用反相HPLC 检测，偶联前多肽、KLH保留时间和偶联物保留时间一般都有差别，另外对比偶联后多肽峰是否消失也可以判定是否偶联成功。
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nikonun[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是紫外检测方法,偶联物和原多肽,KLH的紫外图谱均有所不同,不过没法算偶联率.
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TAT[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只有免疫检测血清的效价才能判断
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 TAT 于 2013-8-8 15:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

只有免疫检测血清的效价才能判断

那样好像很浪费啊，免疫后并不能确定免疫的量，最近很多的公司都在做这方面的工作，不知道他们是怎么做的？
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lixi559[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主这个问题不好办。

MBS是一种双功能试剂，NHS一端可以和KLH上的Lys一类的omega氨基连，另一端的Maleimide可以和Cys的巯基连接，反应产物及其复杂。

KLH连你的12肽都有很多种可能，位点不能保证，连接数也不能，但只要连上了就可以。

怕就怕你的12肽有K、H一类的氨基酸，可以自连的啊，另外N端的alpha氨基也可以和NHS反应导致自连，自连后还是半抗原，这个用来给药效果就不好了。

总的来说检测起来很困难，RP也存在问题，原始肽没有了，但dimer形成了，这个不好确证，SEC可行性不高（KLH分子量太高，加1k很难分开，原始肽分子量又太低）。

楼主可以5K的millipore一下，我印象里MBS很小的样子（貌似只有几百来着），12肽或者24肽也在5K下，看滤过液里低分子肽的含量，与反应前做个比较就大概知道偶联效率了。但更实际的是直接给药看效价。
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发表于 2013-8-8 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lixi559 于 2013-8-8 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主这个问题不好办。

MBS是一种双功能试剂，NHS一端可以和KLH上的Lys一类的omega氨基连，另一端的Maleimide可以和Cys的巯基连接，反应产物及其复杂。

KLH连你的12肽都有很多种可能，位点不能保证，连接数也不能，但只要连上了 ...

关于这个问题我以前已经考虑了很久，并设想了几种方法：

1, 上柱是不合适的，因为KLH是一系列分子量的混合物，没法判断。
2, 比较前后肽的量，也不行，因为除非你能把KLH完全分开，否则C18/C4柱都会堵柱。
3, 电泳分不开，但是可以观察到偶联前后还是有差别。这也是我们现在判断的基本依据。
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发表于 2013-8-8 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有的是检测偶连前后多肽对应的峰是否发生偏移,但是这样的检测在BSA或OVA的检测中看到很多.但是KLH比较大,偶连过程中很容易发生自连,导致沉淀.所以用不同波长检测过程中不会很准确就是了.
我们原来问过Pierce的科服,人家说你只要检测多肽在偶连前后出现减少就证明连接上了,更加精确的检测估计我们不能做.所以你可以问下Pierce的技术人员.
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2013-8-8 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Pierce的科服,人家说你只要检测多肽在偶连前后出现减少就证明连接上了,更加精确的检测估计我们不能做.所以你可以问下Pierce的技术人员.

这个是做不到的。
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