【求助】为什么诱导后细菌数量显著下降？

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标题:【求助】为什么诱导后细菌数量显著下降？

dmg[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用pQE30载体表达我的目的片段时发现细菌数量下降，为此，我做了实验进行验证，取转化有目的质粒的M15菌株培养过夜，再取5ml菌液加入到20ml新鲜LB中，振荡培养，3h后（如图所示的0h），将菌液分到2个三角瓶中，其中一个加入1mM IPTG，另一个加入等量NS，测量OD值，发现经IPTG诱导后细菌数量下降。

另外，我用空载体pQE30做对照，并无此现象。

请问各位大侠：这是什么原因？

附件

2013-8-8 16:01

34625755.jpg (16.9 KB)

大海啊故乡[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大哥，你 0.5左右就诱导？？？诱导剂对菌体生长是有害的，你的OD才0.5，菌体脆弱，承受不住诱导剂的危害。

大海啊故乡[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 大海啊故乡 于 2013-8-8 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大哥，你 0.5左右就诱导？？？诱导剂对菌体生长是有害的，你的OD才0.5，菌体脆弱，承受不住诱导剂的危害。

楼上的观点值得商榷，《分子克隆》上好像是说在0.4~0.6开始诱导，不是很确定，明天到办公室查查。

我设了空载体对照，见图所示，在0h加入IPTG，空载体细菌长得可好了，不受半点影响。

附件

2013-8-8 16:02

94205490.jpg (18.28 KB)

大海啊故乡[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你那是摇瓶还是罐培养？？
我碰上的用IPTG诱导的是应用在发酵培养中的，OD在2~3之间做的诱导。从你下面的生长曲线上看，空菌倒是没问题了，难不成是构建后抵抗能力下降了？

ffooll[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是否是传说中的目的蛋白毒性造成的？用IPTG诱导后表达的目的蛋白对细菌有毒性，抑制了菌体生长。如果这样，建议OD值2－3之间再诱导。

dmg[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在初步怀疑就是目的蛋白的毒性造成的。

谢谢楼上几位的意见。

下一步打算：

1、OD值调整至2以上开始诱导；

2、购买histag抗体，做western进行分析。

kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我前几天诱导也出现这种情况了，最后把IPTG 浓度降低菌体就长了！
可是IPTG 对菌体生长有抑制作用造成的！

dmg[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

后续实验：

我分别用0.1 mM、0.3 mM、1.0 mM、3.0 mM的IPTG进行诱导，结果很是有意思啊，这几个浓度的IPTG均能使细菌OD值下降，但各浓度组间无差异。

欢迎大家讨论。

附件

2013-8-8 16:05

68200010.jpg (18.22 KB)

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很有可能是目的蛋白有毒性，查查文献是否有提及。
还可以采用包涵体表达的方式。比如提高温度到42℃，提高摇床转速等条件，加速目的蛋白表达，使之来不及正确折叠，形成包涵体，就不会对宿主菌产生毒性。

dmg[使用道具]
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发表于 2013-8-8 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很有可能是目的蛋白有毒性，查查文献是否有提及。
还可以采用包涵体表达的方式。比如提高温度到42℃，提高摇床转速等条件，加速目的蛋白表达，使之来不及正确折叠，形成包涵体，就不会对宿主菌产生毒性。

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现在可以基本肯定是目的蛋白的毒性作用。

但是，我的这段基因从没有这方面的报道，难道是新功能？值得研究。

可以这么说，我很关心它的毒性作用，不要包涵体了。

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