样品前处理

　　1. 三聚氰酸介绍

　　三聚氰酸(Cyanuric acid)是一种重要的化工原料，常常用作高分子材料的合成前体、材料粘合剂以及杀菌消毒剂。与三聚氰胺相似，三聚氰酸分子(C3H3N3O3)中也含有较高的氮元素，因而某些不法生产商也将其加入奶制品中以提高蛋白含量，但其并不具备蛋白质的功能。动物实验表明，三聚氰酸基本上是无毒的，然而由于三聚氰酸水溶性较差，一旦人体摄入较大量的三聚氰酸，它会在人体析出沉淀危害泌尿系统。

　　近期，FDA在某国际知名奶粉生产商出品的婴幼儿奶粉检出三聚氰酸，引发了消费者对食品安全的新一轮担心。三聚氰酸进入奶制品大致有四个途径：其一，人为添加;其二，食品中的三聚氰酸转化而成;其三，含有三聚氰酸的食品包装材料向食品中释放;其四，作为杀菌剂的三聚氰酸残留于食品生产设备进而污染食品。前两个途径往往会使三聚氰酸在食品中大量残留，而后两种途径导致的残留量是极低的，基本不会对人体产生危害。

　　食品安全检测是防止三聚氰酸危害消费者的最后一道保险，因而科学有效的分析手段尤为重要。迪马科技及时地推出了一项操作简便、结果准确的三聚氰酸分析方法，希望对分析工作者有所帮助。

　　2. 原理

　　50%乙腈水溶液进行提取，向提取液中加入适量氨水后用混合型阴离子交换柱(ProElut PXA )净化，反相离子对色谱法分析。

　　3. 溶液配制

　　3.1 三聚氰酸标准溶液：将0.0100 g三聚氰酸标准品溶于100 mL 10%甲醇水溶液中，得到100 mg/L的三聚氰酸标准储备液;用流动相将三聚氰酸被准储备液逐级稀释得到10 mg/L、1 mg/L的三聚氰酸标准使用液;

　　3.3 50%乙腈水溶液：将50 mL乙腈与50 mL水混合均匀，得到50%乙腈水溶液;

　　3.4 5%氨水水溶液：将5 mL氨水与95 mL水混合均匀，得到5%氨水水溶液;

　　3.5 2%甲酸甲醇溶液：将2 mL甲酸与98 mL甲醇混合均匀，得到2%甲酸甲醇溶液;

　　3.6 HPLC流动相：缓冲溶液：甲醇=92：8;缓冲溶液：0.005 mol/L四丁基溴化铵+0.005 mol/L磷酸氢二钠水溶液。

　　4 样品提取

　　4.1奶粉样品

　　称取1 g(精确到0.01 g)奶粉置于15 mL离心管中，加入12 mL 50%乙腈水溶液，剧烈震荡2 min，4000 rpm下离心5 min，取4 mL上清液(相当于0.33 g奶粉)与4 mL 5%氨水水溶液混合，混合液待净化。

　　4.2 液态奶样品

　　将5 mL液态奶与5 mL乙腈混合，剧烈震荡2 min，4000 rpm下离心5 min，取2 mL上清液(相当于1 mL液态奶)与2 mL 5%氨水水溶液混合，混合液待净化。

　　注释：乙腈和水对三聚氰酸具有较好的溶解性，保证样品中的三聚氰酸能够被有效地提取出来;提取液中乙腈的比例超过50%时，样品中的蛋白质能被有效沉淀;5%氨水水溶液为碱性环境，此环境下三聚氰酸能给出质子，呈阴离子态，有利于其在阴离子交换柱上被保留。

　　5 SPE净化 ProElut PXA*

　　5.1 活化平衡：

　　5 mL甲醇活化，5 mL 5%氨水水溶液平衡;

　　活化：用甲醇除去吸附剂中的干扰物，并使吸附剂上的基团展开;

　　平衡：用水洗去活化过程进入吸附剂的甲醇，为上样创造合适的溶剂环境;

　　5.2 上 样：

　　将待净化液加入固相萃取柱，流出液弃去;

　　吸附剂上的季铵基团因解离性较强始终呈阳离子态，而碱性条件下，三聚氰酸解离成阴离子，两者间存在库仑力从而使三聚氰酸被保留;

　　5.3 淋 洗：

　　5 mL 5%氨水水溶液、5 mL甲醇依次淋洗，淋洗液弃去;

　　氨水淋洗可增强三聚氰酸阴离子与季铵基团间的库仑力，使三聚氰酸物被稳定保留，并除去蛋白质和盐;

　　纯甲醇淋洗能打断非极性相互作用，除去反相机制保留的干扰物，并洗脱中性和未解离的碱性化合物;

　　5.4 洗 脱：

　　5 mL 2%甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液;

　　甲酸给出质子，使阴离子态的三聚氰酸结合质子呈中性，库伦力被打断，而甲醇则破坏了反相作用力，三聚氰酸被洗脱;

　　5.5 重新溶解：

　　将洗脱液减压蒸馏至近干，1 mL流动相定容，微孔滤膜过滤后供仪器分析。

　　使样品浓缩，并改变溶剂以方便仪器分析。

　　*对于奶粉样品，使用ProElut PXA，500 mg/6 mL小柱;对于液态奶，使用ProElut PXA，150 mg/6 mL小柱。

　　6 HPLC分析条件*

　　色谱柱：Spursil C18，250*4.6 mm，5 μm;

　　流动相：

　　缓冲溶液：甲醇=92：8;缓冲溶液：0.005 mol/L四丁基溴化铵+0.005 mol/L磷酸氢二钠水溶液;

　　流 速：1 mL/min;

　　检 测 器：UV 226 nm;

　　柱 温：30 ℃;

　　进 样 量：20 μL。

　　*本方法中，目标化合物是由HPLC测定的，但这并不表明其他仪器不适合。当使用者采用其他方式进行检测时，同样可以采用本方法进行样品前处理。








附件下载：P112 乳制品中三聚氰酸的分析.pdf

[ 本帖最后由 健康千万家 于 2010-2-23 15:31 编辑 ]

好帖子，谢谢共享！

谢谢楼主分享经验！！

谢谢分享！

迪马这种混合型阴离子交换柱(ProElut PXA )填料的键合相是什么？是硅胶基体的吗？其它公司有同类型的填料吗？

回收率很好，与三聚氰胺相比，哪一个要好检测？

三聚氰胺更容易分析。原因：
三聚氰胺上有六个氨基，是标准的碱性化合物，溶液酸化（加三氟乙酸）后，质子化效果很好，然后上混合型阳离子交换柱（Proelut PXC）净化，目标物保留很好，回收率也较好；
而三聚氰酸，具有烯醇和酮的互变结构，酸性极低，碱化后的到得离子强度低，用混合型阴离子交换柱（ProElut PXA）净化时，保留强度弱，如果有基质存在极易发生穿透现象，所以上样时一定不要过载。最近我在网上看到一些朋友也在做这个项目，用的SPE柱类型比较相似，但都未成功，我的诊断是：上样量大，过载了。
另外对于仪器的要求，三聚氰胺的响应值在UV下灵敏度稍高一些，另分析条件也比较温和；本人实验的条件，三聚氰酸在UV226nm下信噪比最好，但仍低于三聚氰胺，所以检出限稍高一些，但也接近1 mg/kg或1 mg/L，而且流动相的pH值为9.0，这是普通C18不能承受的。
综合而言，上述的前处理方法，是通用的，不论分析仪器是HPLC还是LC-MS还是GC-MS。如果限于条件，使用HPLC分析，上述的条件也比较贴近分析者的使用习惯，因为其他类型的色谱柱寿命往往较短、且不易操作。

ProElut PXA填料结构为带有亲水基团的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物上键合季铵基团，为阳离子态，可以用于保留带有阴离子基团的化合物。不是硅胶基体。功能上比较类似的填料为Oasis MAX。

本人由于工作的原因，有一段时间一直在做Cyanuric acid 和Melamine的检测，这个方法是公司内部的标准，从去年4月份，大家都在做Melamine的时候，我们就两个一起检测，用的是LC/MS/MS，流动相就是乙晴和水，加上10mM的氨水，一针进样，中间切换一下模式（从负模式到正模式），定量限可以达到100ppb。这个方法还是挺好的，值得推荐

三聚氰胺用HPLC也可以做到几百个ppb，用LC-MS有点儿浪费吧？您说的不会是Cyanuric acid 吧？