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标题:【求助】关于未预染Marker的使用问题

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发表于 2013-8-10 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于未预染Marker的使用问题

不好意思，向大家求教一个比较低级的问题，我买的Marker是没有预染的，电泳时只能看到溴酚蓝跑的一条直线.我要做WB:

1.能否在转膜以前把胶用考马斯亮蓝染色,再根据条带位置转膜,以节约膜?
会不会影响后面的免疫检测?

2.我第一次染凝胶后转膜,用的是45伏特,湿式转移,6个小时,结果膜上什么都没有,而胶上的条带还很清楚;

3.第二次电泳时没有染胶,直接电泳的,也是45伏特,7个小时,转膜后用丽春红染膜,考马斯亮蓝染胶,结果竟然胶和膜上都没有条带,我确定转膜时没有转反,是按照负极-胶-膜-正极的顺序放置的,而且跑胶时溴酚蓝在一条直线上,还没有跑到胶的底部,究竟什么原因,实在百思不得其解,急盼各位老师指点,谢谢!!!
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-8-10 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
考染後不能再转膜。
实在想看条带的位置的话，可以将胶上的Marker切下一半先考染，然后根据考染的结果定条带位置，染色后胶的大小虽会变化但变化不大。

我没有做过湿转，一直用半干转，省转移缓冲液啊，转移槽是北京六一厂的，感觉还不错（有广告的嫌疑了呵呵）。问过师兄，第一次显然是考染影响了转膜，第二次应该是转过了（丽春红和考马斯亮蓝没问题吧），我们的条件一般稳流300mA转2h或稳压25V转过夜，都在4度下进行。
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发表于 2013-8-10 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这一次不算作广告,而且解决战友的难题应该鼓励！想来愿意为六一厂的东东做广告的人也不多,呵呵。不过下次如有公开有意宣传某公司的产品、试剂者，本着站长的最新指示，斩－－立－－决！
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发表于 2013-8-10 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 考马斯亮蓝应该是没有问题的,我第一.二次用的是同样的染料,第一次染色还是很清楚的.丽春红用的是以前配制的,不过应该也能看出一点痕迹的啊?

2.您所说的可以切下胶上部分的Marker染色,这倒是个很不错的主意,不过不染色的胶应该如何放置呢,放久了会不会影响后面的结果?

3.转膜转的时间长了的话,蛋白质会转到膜的外面么?(不好意思,很笨的问题是吧?)转膜是在4度冰箱里,45伏7个小时.我的装置是新的,会不会装置有什么问题呢,因为转膜的过程中装置一直是冰冷的,我知道转膜时应该产生很多的热量的啊.

望指点!!!
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发表于 2013-8-10 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜一般都是大电流恒流的。我们是200MA 3小时。你可以一边染你切下的条带，一边转膜的吗。
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2013-8-10 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜转的时间长了的话,蛋白质会转到膜的外面，也就是丢了，这是肯定的！尤其是分子量小的蛋白，小分子量蛋白跑的快，所以，转膜时间一定要控制好，小蛋白时间短一些，大蛋白时间长一些。
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发表于 2013-8-10 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我要测的蛋白是65个KD的，我想下次把时间缩短至4-5个小时再试一次，不过就是膜要费一些了，等我做出结果再来告诉你们，谢谢大家的热心帮助！
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发表于 2013-8-10 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位的帮助,报告大家一个好消息,我这次的转膜成功了,因为我这次用的是别人的电泳仪,45伏,转了6个小时(不过请教其他做过的人说应该用35伏特转6-8个小时),用预染的Marker,电流大概有300多毫安.转后可见有清晰的条带.
而我原来用的电泳仪调至25伏特时电流就会超过它的使用范围,所以一直转不好.
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发表于 2013-8-10 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜转的时间长了的话,蛋白质会转到膜的外面，也就是丢了，这是肯定的！尤其是分子量小的蛋白，小分子量蛋白跑的快，所以，转膜时间一定要控制好，小蛋白时间短一些，大蛋白时间长一些。

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我想不会的，现在用的膜都有很强的吸附能力，不可能会丢失的，因为顶多过液转移，而且不涉及大小的问题。或者不太明显的影响。
这是我16.8KD蛋白转后的结果，明明转了16个小时。不好意思，懒了点！


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发表于 2013-8-10 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用考马斯亮蓝染色后再转膜，肯定是不成功的，因为染液中有甲醇，起固定作用。
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