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标题:【求助】western蛋白浓度测定

okhaha[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western蛋白浓度测定

我的样品是大鼠海马组织，加入裂解液制成脑匀浆后，再加2*Protein SDS Loading Buffer ，煮沸5分钟，然后按照BCA法进行蛋白浓度测定可以吗？没用完的样品经煮沸后直接放在-20度冰箱保存，等做western时直接上样跑电泳可以吗？新手在此求教了！
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

按照BCA法进行蛋白浓度测定 是不可以,只有用非干扰型蛋白浓度测定试剂盒 (SK3071)

直接上样跑电泳不可以，必须补加DTT，在震荡煮沸
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okhaha[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢您的回答，但是我刚咨询了一个师姐，她说组织裂解后直接按BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度就可以不必做别的处理，想保存的样品再加入上样缓冲液震荡煮沸后放冰箱保存就可以了。不知道您说不可以的理由是什么？
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加2*Protein SDS Loading Buffer 煮后,是不能够直接用BCA定量的
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okhaha[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那我想用BCA法测定的话样品应该如何处理？剩余的样品该如何处理并保存呢？求教了！谢谢
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okhaha[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充一下：我现在得到的一种说法是样品加入裂解液后制成匀浆，然后4度离心取上清，即可测定蛋白的浓度。剩余样品加入 2*loading buffer后煮沸放入-20度冰箱即可，但是要在两周内进行western，您看可以吗？
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发表于 2013-8-10 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以的，加热变性前先用BCA法把蛋白浓度测了，其他的假如loading buffer（1：5）煮诽变星后负80度保存备用。
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小游abc[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白定量是煮之前好呢，还是煮之后好呢
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小游abc[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在是煮沸后再蛋白定量，怎么只加裂解液的空白对照孔OD值也很高呢？
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okhaha[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白定量是不能煮沸的，煮沸之后蛋白就会变性没法测了。
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