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标题:【分享帖】DS-PAGE中常见问题你遇到多少

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发表于 2013-8-10 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享帖】DS-PAGE中常见问题你遇到多少

做了两个月的western blot，在跑SDS-PAGE中，几乎遇到了各位战友在站内提到的所有问题（比如胶聚合速度过慢，胶聚合不均匀，胶孔漏样，蛋白带笑脸状等等）。虽然SDS-PAGE做了这么多遍，可每次都有不同的问题出现，所以很是佩服自己“创造”问题的能力。在此把这些问题归纳一下，算是总结经验，也算是给总是失败的自己打打气，更是想把这些经验教训与各位战友分享，希望能给斗争在SDS-PAGE中的战友一些启发，也希望实验做的好的站友多提宝贵建议，让我们这些挣扎在实验失败中的战友少些挫折，多些成功。此帖算是抛砖引玉了！

（1）我们实验室用的灌胶模具包括两块玻璃板，三条spacer（用于两侧和底边）。每次用的时候在玻璃与spacer间涂少量凡士林，然后用夹子夹紧，水平摆放在桌子上。目前未出现过漏胶现象。不知道大家都用的什么模具。我在实验中曾遇到这样的问题，将玻璃板放入电泳槽后，上槽液沿着胶与玻璃板间缓慢漏入下槽液（靠近spacer），即胶与spacer间出现缝隙。考虑可能的原因有凡士林涂的过多，玻璃板不干净，两侧夹板没夹紧。后来在这3个方面注意了一下，就没再出现这样的问题。

（2）胶聚合速度过慢。我们开始做的时候用的是前人配的tris缓冲液和acrylamide溶液。APS和SDS为新配制的。但是胶的聚合速度（包括分离胶和浓缩胶）都超过了1个小时，浓缩胶竟达到了2个小时。后来重新配了tris缓冲液和acrylamide溶液，胶的聚合速度在30分钟左右，比较正常。后来每过一个月我们就重新配制tris缓冲液。

（3）浓缩胶聚合不均匀。浓缩胶聚合后，可见在胶孔下方有成串的“波纹”，通过折光可以看到。有次实验中，这些“波纹”格外多，格外大，当取出梳子后（已经聚合1个小时），胶孔下有“波纹”的地方，没有形成成型的well（胶孔下没有“波纹”的形成很好的孔道），即梳子齿与齿间的部分只有水而没有胶，所以即使再过2个小时，那个地方也不会形成完整的well。后来灌浓缩胶时改了方法，即在灌浓缩胶以前，先把梳子斜插进去，待胶配好后，迅速摇匀，从一侧缓慢加入，让胶面自然漫过梳子，胶灌完后只需将一侧梳子往下压一点就好了。以前我们是先把胶灌完后再往里面插梳子，这样速度慢，部分胶己经开始聚合，这时如果再插梳子，向下的冲力毕竟破坏了胶的均匀度，导致胶聚合不匀。

（4）胶孔漏样。昨天跑胶的时候，其中一个孔在电泳后20分钟左右开始漏样，一条细的淡蓝色的条纹从胶孔底部直接到达了浓缩胶与分离胶界面处而且有横向扩散。但是大部分样品并没有顺着漏出，还是以正常速度下行。因为上样很多，不能因为一个孔漏就停下来，所以硬着头皮继续跑。到了分离胶部分后，前面漏出的淡蓝色的条纹逐渐变浅，而且后面的蛋白逐渐“追赶”上，过了中间部分后，几乎看不到二者有前后之分了。转完膜后用Ponceau S染色，看到很多条带，担心是因为漏样造成样品串样。但是今天显影后，还得到了不错的结果，获得了预期的单条带。究竟最初那个胶孔为什么会漏，现在还想不到合理的解释。是否与拔梳子的方法有关？每次上样前都用注射器往孔道里注入running buffer，排除气体及未聚合的丙烯酰胺，向下的冲力会损坏孔道“薄弱”的部分吗（注射器针头离孔道底有段距离，不会损伤到孔道）？

（5）条带成笑脸状。做了这么多次SDS-PAGE，就一次出现了笑脸状条带。主要考虑是胶没有混匀，胶的聚合不均。

（6）加水封分离胶。前辈教我是从一边把水灌入，让水自然从一侧流到另一侧；后来老师说不对，要拿枪头把少量水从不同的地方灌入，这样就不会出现局部胶过度稀释的问题。我觉得老师这样说有道理。但是做的时候又出现了一个问题：如果这样灌水，就会有很多水印留在上层玻璃上。浓缩胶聚合后就会在这些水印处呈现一些“波纹”，与水印的形状相似。波纹严重的时候会影响带的形状。不知道大家在加完分离胶后是如果加水封顶的。

（7）还有一个问题不知道大家碰到过没有。梳子的一端在浓缩胶里会自己往下降（非持续下降）。开始梳子明明是摆放水平的，但后来就倾斜了。考虑胶已经开始聚合，就不敢再移动梳子了。事实上梳子的厚度和spacer的厚度是一样的，而且梳子在胶里也有一定的浮力，可还是出现这样的问题，不知道这是什么原因。

另外还有一些细节，如倒掉封分离胶的水，拔梳子等，都会影响到实验结果。希望我遇到的这些问题能给大家提点醒，在实验中多加注意，得到好的结果就不难了。如果有战友能给些更好的建议，吾将非常感谢！

祝大家实验顺利！
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发表于 2013-8-10 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于第六点
加完分离胶后小弟一般是用75%的酒精封顶的，不知道这样做是否正确？
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酒精也可以，不过胶板洗干净后很少出现楼主说的问题的
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DONT[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于第四条，不知道版主现在有没有找到原因，我也出现这种情况，而且换了试剂和玻板斗不管用，以前做好好的，不知道现在怎么出现的。
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发表于 2013-8-10 13:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于第一点，其实主要的要保证你的两块玻璃不要有任何的缺刻（底部），否则很容易漏胶。你们应该用的是第二代的电泳槽或者是自制的（第三代的电泳槽很少出现漏胶现象）。关于此，我的经验是将小玻璃面向自己，左右两边放置Spacer之后把玻璃上缘轻轻向怀里倾斜，这样大小玻璃底部大概有半毫米左右的差距，然后上紧螺丝（拧的时候我一般是成对角线拧，并且不要一步到位，而是四个角换着拧，这样容易受力均匀）。什么都不用加，我几乎从来不漏胶。同实验室的人常常用琼脂糖凝胶封底，效果也很一般。这可是一个私人绝活哦。
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发表于 2013-8-10 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于第四条，胶孔漏样的原因现在还没有找到很好的解释，但是保证浓缩胶完全聚合，保证加浓缩胶之前彻底清除封顶水，保证拔梳子时小心别破坏胶孔，这样的问题几乎就能避免。我和实验室另一位室友没人遇到过一次，后来就再没有发生过这种情况。东阳水仙战友可以在这些细节上多加注意。希望这几个小点对您有帮助！：）

祝好运！
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发表于 2013-8-10 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于加水封分离胶出现的问题,我们是加异丙醇封分离胶的,优点是压得严实,还有分离胶凝固后倾倒掉异丙醇后,剩下的一点易被纸吸尽,或者挥发掉,不会留下水印
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发表于 2013-8-10 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

封胶的时候我们实验室用的是正丁醇，不过气味的却太大了
《蛋白质与蛋白组学实验指南》上面推荐用正丁醇或异丁醇（异丙醇也可以）
用水上层会稀释，并且表面不平
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子衿青青[使用道具]
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 小中大

拔梳子很重要，猜测这是造成胶孔漏样的主要原因
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jujuba[使用道具]
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发表于 2013-8-10 13:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
    我们封胶不用水，而是用75%的酒精，效果非常好，几乎不需要注意什么，加时很潇洒的从一侧划到另一侧，凝固后胶就非常齐了，也无气味。用水封容易压不齐，毕竟水的比重还是挺大的。
　　关于漏胶，我很少碰到过，我们用一个三面封闭的胶条，也不涂什么凡士林油。
　　最好在37度温箱里烤一下（大概二十分钟）这样胶与梳子容易分开，拨梳子就容易了。
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