小中大【求助】Problems about PhosphoProtein Purification
冷泉港有一本很经典的书，叫《蛋白质纯化与鉴定实验指南》。其中的附录7给出了用亚氨基乙二酸（铁螯合）Sepharose 6B分离磷酸肽的方法。后面有2篇参考文献，最重要的那篇因为发表时间太久远了（Muszynska, G., L. Andersson, and J. Porath. 1986. Selective adsorption of phosphoproteins on gel-immobilized
ferric chelate. Biochemistry 25:6850-6853）的，所以拿不到全文。因此我对里面操作流程的原理不明白。想向大家请教。下面我把它的整个流程写出来：
全部操作均在室温下进行：
1）用4体积H2O洗亚氨基乙二酸Sepharose 6B柱。
2）用4体积含100mmol/L EDTA 和500mmol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl(pH7.6)洗柱。
3）用4体积H2O洗柱。
4）用4体积50mmol/L氯化铁洗柱。
5）用2体积0.1mmol/L乙酸洗柱。
6）加肽混合物（溶于0.1mmol/L乙酸）于柱上。
7）用2体积的0.1mmol/L乙酸洗柱。
8）用2体积0.1mmol/L乙酸钠（pH 5.0）洗柱。
9）用3体积1％乙酸铵(pH6.3)洗柱。
10）用4体积1％乙酸铵(pH8.3)洗脱磷酸肽。
11）分部收集0.5～1.0ml样品。按pH合并样品。用Speed-Vac型旋转浓缩器浓缩，分析磷酸肽。
12）洗脱后，立即用4体积0.2mol/L EDTA洗柱。
上述流程中，我不明白的有以下几个问题：
（1）用2体积0.1mmol/L乙酸钠（pH 5.0）洗柱的目的是什么？
（2）用3体积1％乙酸铵(pH6.3)洗柱的目的是什么？
（3）用金属螯合的方法纯化蛋白，一般最后洗脱时都是通过降低pH来实现的。磷酸基团本身就是碱性的，为什么用碱性的1％乙酸铵(pH8.3)能洗脱磷酸肽？
（4）我在pubmed查的许多相关文献都拿不到全文，但通过看摘要，有几篇文献显示磷酸化蛋白与这种螯合铁结合的部位很可能是两个临近的丝氨酸。但能使蛋白活性发生改变的磷酸化通常发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。那我怀疑这种方法是不是对发生在苏氨酸和酪氨酸上的磷酸化不能选择性地纯化。
（5）我想定购这种柱子，我在网上查到的信息，包括Amersham、Sigma等进口品牌或是国产的柱子，虽然它们都是Sepharose 6B，活性配基也是亚氨基乙二酸，但它们的Protocal上却几乎都是针对6His-融合蛋白的纯化问题。而我查到的文献中也有把组氨酸残基上发生磷酸化的蛋白用这种方法来纯化。如果是这样的话，那这种磷酸化蛋白显然不是我想研究的对象。所以我怀疑这种铁螯合的亲和层析是不是主要针对组氨酸发生磷酸化的蛋白。
（6）还有一些文献显示，除了铁，镓似乎对磷酸化蛋白的纯化作用要更特异一些，还有某些金属也有类似的作用（因为看的是摘要，所有也不知道包括哪些金属）。那这么说的话，岂不是用这种方法纯化磷酸化蛋白并不特异？
这些问题这几天一直困扰着我，我的实验也处于停滞状态，导师希望我能够建立起一种大批量纯化磷酸化蛋白（当然主要是研究丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上发生的磷酸化）的技术平台。所以我的压力很大。希望各位高手多指教，帮我一起解决这个技术难题。十分感谢！！
