小中大【求助】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 ！
我上个月做了 mating （酵母双杂交的一种办法）。
现在已经做到了，X-gal assay。
从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。
What can I do for it NEXT~
我的具体步骤是。
一 ：文库建立
1. mammalian cell total RNA --> Poly A RNA --> dsRNA --> 提纯 dsRNA。
2. 将提纯的dsRNA 转染到AH109细胞株,涂在 150ㅠ待 3~5天克隆出现 并长势饱满.
3. 每个150ㅠ， 放入5ml freezing media ，将细胞收集在一起，均匀混合，1ml 分装， -70度保存。
二 ：酵母双杂交
1 . mating , mating product 分别涂在 40个 TDO（SD/-H -L -T）， 10个 QDO( SD/-A-H-L-T) 。
2 . mating efficiency 3% 大于下限值2%。
3 . 实验步骤说明上，说3-8天克隆会出现。可是我的 大概 12天才长了出来（TDO）。
小心的将 TDO上长出来的 280个克隆，转移到TDO。
再次培养了４天左右 发现 21个在转移后没有继续长，所以淘汰掉。
４．将TDO上的克隆，转移到 QDO （for strong interaction assay ）／ 牙签上 剩下的一点点细胞 划在了100ㅠ的TDO(for colony X-a-gal filter assay) 。 双重选择，在QDO上生长，并在X-a-gal筛选中变蓝的克隆。
5. 以上方法，选出223个在 QDO 上生长的克隆。
6. X-a-gal filter assay 两次。
到这里 问题出来了 从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。
而且，书上说 X-a-gal filter assay最多不要超过８小时。
可是我的克隆，基本都是在６－８小时之间 变蓝的。
请大家 一起分析一下，怎么两次 X-a-gal filter assay 变蓝的差距这么大。
难道，都是假阳性？？
我首先将两次实验重合的 11个克隆的 plasmid DNA 提了出来，正在测序。
剩下的怎么办？ 11个也太少了，之后的实验，怎么办？ 有必要 再作一次 X-a-gal filter assay么？？ 要是，又发生么变化，怎么办？？
拜托各位！！ ！
