【求助】胶体考染与银染的可能机理

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标题:【求助】胶体考染与银染的可能机理

am10[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 胶体考染
PAGE胶经G250胶体考染后可以获得无背景或很低的背景.估计其染色机制是因为在胶体染料和溶液中的自由扩散染料间形成平衡,溶液的少量自由染料穿透凝胶基质,有选择性地对蛋白质染色,而胶体态的染料排阻在胶外,阻止了背景生成.

2 银染
经典银染方法是将二维电泳凝胶在固定液中固定后,在含戊二醛的溶液中增敏,然后在AgAO3溶液中浸泡,蛋白与银离子结合,凝胶空白背景中的银离子由于结合不牢,大部分被洗去,而含蛋白质的区域则由于蛋白质中自由氨基与银离子的相互作用,使这些位置的银离子没能被洗去,随后在碱性环境中,甲醛溶液将结合在蛋白带上的银离子还原为金属银,银颗粒沉积在蛋白点上,沉淀的银颗粒又产生自催化反应,提高银染反应灵敏度,使蛋白点显示棕黄色或棕黑色.

am10[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

胶体考染法请参考:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1391803&sty=1&tpg=2&age=0')
银染请参考:

附件

2013-8-16 16:31

91240175.snap.jpg (59.85 KB)

moonlight45[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

12 银染

经典银染方法是将二维电泳凝胶在固定液中固定后,在含戊二醛的溶液中增敏,

考虑到戊二醛影响质谱鉴定结果，一般在敏化时都不加戊二醛，故增敏因该是硫代硫酸钠，考虑到硫的+2价。同样是猜想。期待高手讨论。

说实话，想出银染和胶内酶解过程的人简直是天才。

am10[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在我贴出的银染方案里,增敏就有不同的方法.实际上银染有两个类型,见下:

1分析型银染(不能用于质谱鉴定)-科学通报,2000,45:170-178
(1)水洗胶5min
(2)40%乙醇,10%乙酸固定1h
(3)5%乙醇,5%乙酸固定过夜
(4)水洗20min,重复2遍.
(5)5%戊二醛1h
水洗30min,重复4遍
(7)250ml新鲜配制的银氨液(1ml NaOH与5ml饱和氨水混合再加10ml 20%硝酸银)/胶45min
水洗3min,重复3遍
(9)1.5ml 1%柠檬酸,125ul 37%甲醛/胶显色.
(10)5%乙酸停显10min
(11)水洗10min,重复3遍.

2快速银染(和质谱鉴定相匹配)----Electrophoresis,2000,21:3666-3672
(1)水洗5min
(2)40%乙醇,10%乙酸重复固定15min,重复2遍
(3)30%乙醇,0.2硫代硫酸钠,6.8%乙酸钠30min
(4)水洗5min,重复3遍
(5)2.5%碳酸钠,0.04%的福尔马林(36%甲醛溶液)显影至背景出现
1.46% EDTA 溶液停显10min
(7)水洗10min,重复3遍.

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发表于 2013-8-16 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

任何事物都不是绝对的,只要您给我100pmol以上的蛋白质,即使加了戊二醛仍然有希望鉴定出蛋白质,呵呵

xue258[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2. 快速银染(和质谱鉴定相匹配)----Electrophoresis,2000,21:3666-3672
(1)水洗5min
(2)40%乙醇,10%乙酸重复固定15min,重复2遍
(3)30%乙醇,0.2硫代硫酸钠,6.8%乙酸钠30min
(4)水洗5min,重复3遍
(5)2.5%碳酸钠,0.04%的福尔马林(36%甲醛溶液)显影至背景出现
1.46% EDTA 溶液停显10min
(7)水洗10min,重复3遍.

==================================

呵呵，一个小bug，楼主可别忘了加AgNO3哦:p

xue258[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:40 资料个人空间短消息加为好友

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2 银染
经典银染方法是将二维电泳凝胶在固定液中固定后,在含戊二醛的溶液中增敏,然后在AgAO3溶液中浸泡,蛋白与银离子结合,凝胶空白背景中的银离子由于结合不牢,大部分被洗去,而含蛋白质的区域则由于蛋白质中自由氨基与银离子的相互作用,使这些位置的银离子没能被洗去,随后在碱性环境中,甲醛溶液将结合在蛋白带上的银离子还原为金属银,银颗粒沉积在蛋白点上,沉淀的银颗粒又产生自催化反应,提高银染反应灵敏度,使蛋白点显示棕黄色或棕黑色.

=================================================

我记得还有一点，银染的话，银离子主要是和Lys一种氨基酸结合
所以如果你的蛋白中正好是lys比较少的话可能就比较麻烦:p
而Sypro ruby可以和3种氨基酸结合而达到更好的检测效果

am10[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很抱歉,因为参考别人的内容,未加鉴定.出现失误.通过参考原文,将快速银染法重新校对如下:

2快速银染(和质谱鉴定相匹配)----Electrophoresis,2000,21:3666-3672
(1)水洗5min
(2)100ml甲醇,25ml乙酸,125ml双蒸水重复固定15min,重复2遍
(3)75ml甲醇,10ml 5%硫代硫酸钠,17g乙酸钠,165ml水,30min
(4)水洗5min,重复3遍

(5)25ml 2.5%硝酸银,225ml双蒸水20min,

6.25碳酸钠,100ul的福尔马林(36%甲醛溶液),250ml双蒸水,显影至背景出现
(7)1.46% EDTA 溶液停显10min
水洗5min,重复3遍.

wood533[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

说实话，想出银染和胶内酶解过程的人简直是天才。

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我猜银染的idea是从原始的组织银染法演化来的吧？
不知道哪位清楚这段历史？

wood533[使用道具]
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发表于 2013-8-16 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很抱歉,因为参考别人的内容,未加鉴定.出现失误.通过参考原文,将快速银染法重新校对如下:
2快速银染(和质谱鉴定相匹配)----Electrophoresis,2000,21:3666-3672

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原始文献在这里，需要的朋友请下载参考：
cuturl('http://coolpizza5.hollosite.com/silver.pdf')

另外推荐 Dr.Gorg关于银染比较的文献:
cuturl('http://coolpizza5.hollosite.com/silver2.pdf')

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