【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

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标题:【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

veiwu[使用道具]
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发表于 2013-8-17 15:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是新手做聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，1）配制分离胶和浓缩胶的浓度是怎样的？
2）我要做凝胶的正交实验，选出同工酶酶带最好的分离胶和浓缩胶浓度，应该怎样设计，各成分的体积需要多少？
谢谢！

ending[使用道具]
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发表于 2013-8-17 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

三、SDS-PAGE电泳篇
Q11. SDS-PAGE电泳的基本原理？
A11. SDS-PAGE凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=k–bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q12. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？
A12. 在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCl缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl–却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

Q13. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
A13. 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择Tris-HCl系统；
TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

Q14. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？
A14. 1. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4°C冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
2. 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法。

Q15. SDS-PAGE样品如何处理？
A15. 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1. 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2. 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，室温保温30min。
3. 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

nn255[使用道具]
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发表于 2013-8-17 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

内部的FQA内容，有些内容对新手还是很有意义的

veiwu[使用道具]
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发表于 2013-8-17 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢了！
可是我做的不是SDS-PAGE,只是PAGE呢？
是一样的吗？
还有我看文章经常出现的例如：5×之类的数字符号，是什么意思？Marker的意思呢？

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-8-17 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢了！
可是我做的不是SDS-PAGE,只是PAGE呢？
是一样的吗？
还有我看文章经常出现的例如：5×之类的数字符号，是什么意思？Marker的意思呢？

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5*是5倍的意思，通常配胶用的溶液都会先配成储液，用的时候再稀释。Marker就是分子量标准蛋白，点样的时候和你的样品一起跑，用来估算样品的分子量

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发表于 2013-8-17 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很好，制好的胶在室温能存放4天吗？

tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-8-17 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

要在4度存放

plaa[使用道具]
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