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标题:【求助】脱盐柱

扫雷军kuzi[使用道具]
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【求助】脱盐柱

我用G15凝胶填料来脱盐。但是上完样品后,一点活性活性都没有了。
我的样品的处理:80%的硫酸铵沉淀发酵液的上清液后,用蒸馏水溶解样品,然后上G15脱盐柱(自己填的柱子),柱体积是68.9mL,上样体积为5mL,流速为1mL/min,流动相为蒸馏水,收集样品后浓缩为约4mL,检测发现没有活性了。电导检测,也脱掉了部分盐。
我之所以选用G15的填料来脱盐,是因为我的样品的分子量大约在4到5 kD。
实在想不明白,经过了简单的凝胶柱,样品怎么会没有了活性呢?太奇怪了,所以上来,求助,请大家帮忙分析一下,或者有什么好的建议呢?
我目的就是想脱盐,因为分子量小,所以透析的损失很小,所以选用G15凝胶填料来脱盐。是不是脱盐柱对流动相也有要求呢?

急盼大家回复!
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summerxx[使用道具]
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是不是你的样品不适合保存在蒸馏水里,所以失活了。
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扫雷军kuzi[使用道具]
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恩,有这种可能。
我的样品以前都是直接硫酸铵沉淀完之后,用蒸馏水溶解,然后放在4℃或者-20℃保存,但是发现,在4℃保存的样品,再检测的时候就没有了活性了。
那一般都保存在什么溶液里呢?有保存在醋酸缓冲液里的吗?
能帮忙解释一下,样品保存在缓冲液里时,缓冲液起什么作用吗?另外,我的样品在酸性条件下(PH值3左右)才显示活性。pH值大于4,就不行了。
非常感谢!
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雪山飞鹿[使用道具]
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个人意见,保存在中性缓冲溶液中,例如pH7.4的PBS,使用时调节pH至酸性。
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为什么建议保存在中性缓冲液里呢?能解释一下吗?
谢谢!
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低pH和高pH体系均会促进蛋白质水解。
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扫雷军kuzi[使用道具]
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但是,把中性缓冲液调为酸性状态,要加很多的酸,稀释作用也挺大。
另外,我想试试看,不但用缓冲液溶解盐析后的沉淀,在接下来的凝胶脱盐时,也用缓冲液作为流动相。想问下,你觉得,如果缓冲液作为流动相脱盐时,那么你建议流动相是中性条件的PBs,还是酸性条件的缓冲液呢?
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雪山飞鹿[使用道具]
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中性条件。

G25柱。可以对4-5kd蛋白脱盐。

如果觉得调节酸性会稀释样品,缓冲体系用低浓度的如1-5mM。
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QUOTE:
原帖由 雪山飞鹿 于 2013-8-17 17:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

中性条件。

G25柱。可以对4-5kd蛋白脱盐。

如果觉得调节酸性会稀释样品,缓冲体系用低浓度的如1-5mM。

G25的分离范围是1000到5000的,G15和G25比较为什么建议我用G25来脱盐呢?
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雪山飞鹿[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 扫雷军kuzi 于 2013-8-17 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


G25的分离范围是1000到5000的,G15和G25比较为什么建议我用G25来脱盐呢?

那是对球蛋白的理论值。实际操作来看,G25(fine)脱盐3-4kd的蛋白没有什么问题,我做过不止一种、多次。
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